Ex vivo expansion of HSPC is an unmet medical need in gene therapy and regenerative medicine, to compensate for HSPC loss during manufacturing, to enable ex vivo gene therapy for young infants where leukapheresis is unfeasible & large volume bone marrow (BM) harvest is unsafe and to enable more complex genetic engineering such as gene editing & selection of engineered cells. We have optimized a small molecule-based expansion protocol for genetically engineered mPB HSPC starting from our previous studies (Zonari E. et al.). We first evaluated 2 HSC agonists, UM171 (Horwitz, M.E. et al.) and SR1 (Wagner, J. E. et al.), in their capacity to support short-term and long-term engraftment. Next, we investigated the best cytokine cocktail to have good growth and maintenance of a primitive immunophenotype that resulted in a net gain in primitive cells, which translated into higher engraftment. Moreover, lentiviral transduction was not completely neutral, even when purified vectors were used, and counteracted the expansion of primitive cells. Transduction enhancers (TEs) had variable effects, with some molecules showing strong antagonism to HSC expansion. By optimising the choice of TEs and the timing of transduction, we were able to neutralise the negative effects of the genetic engineering step. We also evaluate clonal analysis of an expanded (EX) versus a minimally-manipulated (MM) HSPC graft. A lentiviral vector library, whereby each particle contains a unique barcode sequence (BAR-LV), was generated, and validated for NGS detectability & complexity. MPB CD34+ HSPC were transduced with BAR-LV yielding on average two copies per cell. Human CD45+ engraftment at 16 weeks was similar between MM and EX when the same starting cell dose equivalent was transplanted. Graft clonality gave similar results. The graft was polyclonal with no evidence of clonal dominance. The number of unique clones was higher in the EX compared to the MM group at the same starting dose equivalent. These novel readouts will facilitate the development of improved expansion protocols. In conclusion, we present a revisited expansion protocol based on clinically-validated compounds and tailored to genetically-engineered mPB HSC, towards harnessing the full potential of ex vivo HSC expansion in the gene therapy context.

Espansione Ex vivo di cellule staminali ematopoietiche (CSE) per la terapia genica L'espansione ex vivo delle cellule staminali ematopoietiche (CSE) è un'esigenza medica al momento insoddisfatta nel campo della terapia genica e nella medicina rigenerativa. L'espansione di CSE è importante per compensare la loro perdita durante la produzione, per consentire la terapia genica ex vivo nei neonati in cui la leucaferesi non è fattibile e il prelievo di grandi volumi di midollo osseo non è sicuro e per consentire un'ingegneria genetica più complessa, come l'editing genico e la selezione delle cellule ingegnerizzate. Abbiamo ottimizzato un protocollo di espansione per le CSE geneticamente modificate ottenute da sangue mobilizzato basato su small molecules. Abbiamo dapprima valutato due agonisti delle CSE, UM171 e SR1, e abbiamo verificato che UM171 da solo è in grado di fornire lo stesso attecchimento a lungo termine della sua combinazione con SR1. Successivamente, abbiamo studiato il miglior cocktail di citochine per ottenere una buona crescita e il mantenimento delle loro caratteristiche concludendo che l'inclusione di IL3 e IL6 nel cocktail standard ha portato a un incremento di cellule primitive, che si è tradotto in un maggiore attecchimento. Inoltre, la trasduzione con vettori lentivirali non è completamente neutra. Anche quando vengono utilizzati vettori purificati, abbiamo osservato un impatto negativo sull'espansione delle cellule primitive. Anche l'utilizzo di adiuvanti di trasduzione (TE) hanno dato effetti variabili, con alcune molecole che hanno mostrato un forte antagonismo all'espansione delle CSE. Ottimizzando la scelta dei TE e la tempistica della trasduzione, siamo riusciti a neutralizzare gli effetti negativi della fase di ingegneria genetica. Abbiamo valutato anche l'analisi clonale di un trapianto di CSE espanse (EX) rispetto a cellule che hanno subito una manipolazione minima (MM) in un modello murino umanizzato. È stata generata una libreria di vettori lentivirali, in cui ogni particella contiene un codice a barre unico (BAR-LV). L'incidenza di CD45+ umane a 16 settimane è risultata simile tra MM ed EX trapiantando dosi iniziali equivalenti di cellule. La clonalità del trapianto ha dato risultati sorprendentemente simili. L'attecchimento era policlonale senza alcuna evidenza di cloni dominanti. Il numero di cloni unici era maggiore nel gruppo EX rispetto al gruppo MM a parità di dose equivalente iniziale. In conclusione, presentiamo un protocollo di espansione rivisitato, basato su composti validati clinicamente e adattato alle CSE mPB geneticamente ingegnerizzate, per sfruttare appieno il potenziale dell'espansione ex vivo delle CSE nel contesto della terapia genica.

Horwitz, M. E. et al. Phase I/II Study of Stem-Cell Transplantation Using a Single Cord Blood Unit Expanded Ex Vivo With Nicotinamide. Journal of Clinical Oncology 37, (2019). Wagner, J. E. et al. Phase I/II Trial of StemRegenin-1 Expanded Umbilical Cord Blood Hematopoietic Stem Cells Supports Testing as a Stand-Alone Graft. Cell Stem Cell 18, (2016). Zonari, E. et al. Efficient Ex Vivo Engineering and Expansion of Highly Purified Human Hematopoietic Stem and Progenitor Cell Populations for Gene Therapy. Stem Cell Reports 8, (2017).

Autosomal recessive osteopetrosis (ARO)

Osteopetrosi autosomica recessiva (ARO)