Autosomal Recessive Osteopetrosis (ARO) is a rare genetic disease, affecting osteoclast differentiation or function. The majority of ARO patients (55%) presents mutations in TCIRG1 gene, encoding the a3 subunit of V-ATPase proton pump, necessary for bone resorption. Osteoclast dysfunction results in limited bone marrow (BM) cavity and increased number of circulating CD34+ cells. Symptoms include dense and brittle bones, anaemia, and progressive nerve compression, leading to death in the first decade of life. To date, allogeneic hematopoietic stem cell (HSC) transplantation is the treatment of choice, but its application is limited by availability of HLA-matched donor, toxicity of conditioning regimens and significant transplant-related morbidity. Gene therapy (GT) represents an alternative option. We have established a novel GT platform coupling lentiviral transduction of circulating CD34+ cells with ex-vivo UM171-mediated expansion, to maximize the chance of infusing a saturating dose of gene-corrected hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) into the patients. We aim to consolidate the GT procedure characterizing the circulating CD34+ cells as a new HSPC source, investigating the effect of mobilization on the fibrotic BM niche and assessing the effect of novel non genotoxic conditioning.
We set up single cell RNA-sequencing on CD34+ cells from healthy donor cord blood. Preliminary results show that the transcriptomic profile at day 0 differs from that of cells at the end of the expansion period (day 8), while transduction has a minor impact. Of note, cluster of cells with signature of primitive HSCs are still present at day 8, in line with the maintained HSC stemness that we observed in vivo in NSG mice. The assessment of single-cell transcriptomic profile of circulating CD34+ cells from ARO patients is ongoing and will be instrumental to understand the suitability of this source for the GT.
The high frequency of circulating CD34+ cells, especially in younger patients, has been exploited for the collection of backups before HSC transplant. We modelled the efficacy of drug-induced mobilization in the fibrotic BM niche of the osteopetrotic oc/oc mouse model. We observed the Plerixafor-induced mobilization of HSPCs in the oc/oc mice at post-natal day 7. Finally, to reduce the burden of conditioning toxicity, we tested the efficacy of antibody-drug conjugates in promoting donor cell engraftment in the oc/oc mice. Conditioning with anti-CD45 conjugated to saporin showed a low but stable engraftment of donor cells in blood and hematopoietic organs, allowing the long-term survival of oc/oc mice well beyond their expected lifespan of 3 weeks.
Data from this project will be instrumental to tailor the gene therapy protocol to the peculiarity of ARO disease, with the final aim to improve the outcome and reduce to burden for patients.
Analisi della nicchia osteopetrotica e la sua implicazione nella terapia genica
La osteopetrosi maligna infantile causata da difetti nel gene TCIRG1 è una malattia severa caratterizzata da fibrosi ossea, epatosplenomegalia e progressiva fibrosi del midollo osseo con conseguente immunodeficienza e aumentata suscettibilità a sviluppare infezioni. La malattia porta a morte nel primo anno di vita se non trattata da trapianto ematopoietico che rimane il trattamento di scelta e il cui successo rimane limitato dato il numero ristretto di donatori compatibili, gli effetti severi della terapia di condizionamento che precede il trapianto e gli eventi avversi legati alla fase post-trapianto. Per curare questa malattia e superare tali difficoltà, abbiamo sviluppato una piattaforma innovativa di terapia genica sfruttando un nuovo protocollo di trasduzione ed espansione di cellule staminali ematopoietiche che circolano spontaneamente nel sangue periferico di questi pazienti. In questo progetto, ci proponiamo di studiare il profilo molecolare e cellulare delle cellule staminali ematopoietiche circolanti nel sangue dei pazienti e gli effetti della terapia genica sul loro profilo trascrizionale oltre a valutare l'impatto che la malattia ha sulla staminalità di queste cellule e sulla loro quiescenza. In parallelo, valuteremo la fattibilità e l'efficacia della mobilizzazione in assenza di una nicchia del midollo e la efficacia di nuovi condizionamenti non genotossici sfruttando il modello murino della malattia. In parallelo, ci proponiamo di generare un nuovo modello murino osteopetrotico umanizzato da utilizzare come strumento per lo studio della biologia delle cellule staminali ematopoietiche circolanti corrette dalla terapia genica. In conclusione, ci aspettiamo che i risultati di questo studio permettano una maggior implementazione della piattaforma di terapia genica da offrire ai pazienti per la cura di questa severa malattia.
Autosomal Recessive Osteopetrosis