Catel-Manzke syndrome (CMS) is a rare autosomal recessive disorder characterized by the presence of the Pierre-Robin sequence (micrognathia, glossoptosis and cleft palate) and clinodactylia of the index fingers caused the presence of an extra bone at the base of the first phalanx (1). Associated skeletal abnormalities and heart defects have also been observed. To date 41 affected individuals have been reported, displaying homozygous and compound-heterozygous mutations in the TGDS gene (2). TGDS is currently annotated in the database as dTDP-glucose 4,6 dehydratase, due to its homology with the bacterial enzymes involved in the dTDP-rhamnose biosynthetic pathway; however, this pathway was never reported in vertebrates. The homology with enzymes of nucleotide sugar metabolism and the clinical presentation of CMS led to the suggestion that TGDS could be involved in glycosaminoglycan (GAG) formation (3). However, no biochemical evidence is available and TGDS function remains unknown.
In the perspective of developing a model to study the defects observed in CMS, we have identified and characterized zebrafish Tgds. The gene is not currently annotated in GRCz11 assembly; thus, other assemblies of chromosome 6 were used to identify the gene structure. Two mRNA isoforms are reported in the databases, due to alternative splicing; one, indicated as the reference transcript, presents a premature stop leading to a 274 amino acid long product, while the other encodes for a full length protein of 347 residues. RT-PCR demonstrated that this latter transcript is the prevalently expressed in all tissues and developmental stages. The protein has 70% id. with human TGDS and 50% id. with the recently characterized UGD from Trichomonas vaginalis, which catalyzes the dehydration of UDP-glucose (4).
The longer protein isoform expressed in E. coli exhibited the expected dehydratase activity, specific for UDP-glucose as substrate; no catalytic activity was observed on UDP-glucuronic acid, thus excluding a direct role on UDP-xylose production. The variant zebrafish proteins obtained by site-directed mutagenesis of the amino acids corresponding to the mutations in CMS patients showed reduced catalytic activity and stability, thus confirming their identification as damaging. Alpha-fold2 modeling of Tgds structure revealed the role of these residues in protein folding or interaction with the NAD+ coenzyme.
RT-qPCR demonstrated the highest expression levels during the initial stages of development; in adult tissues, high levels of transcript were found in ovary and lower expression in brain and eye.
These preliminary results pose the basis for the development of a zebrafish knock-out model to study the morphological, molecular and biochemical alterations induced by the gene loss and to identify Tgds functional role in vertebrates.
La sindrome di Catel-Manzke (CMS) è una malattia autosomica recessiva molto rara; il gene coinvolto è TGDS, situato sul cromosoma 13. La sintomatologia è caratterizzata dalla cosiddetta "sequenza di Pierre-Robin": i pazienti presentano una mandibola molto piccola, palatoschisi e la tendenza della lingua ad occludere le vie aree e digestive. Queste malformazioni creano i problemi principali ai pazienti, soprattutto nel periodo neonatale, per difficoltà nella respirazione e nella deglutizione. Un'altra caratteristica è la presenza di una falange aggiuntiva a carico del dito indice, che porta ad una caratteristica deviazione del dito (clinodattilia). Altre malformazioni sono state osservate a livello cardiaco, articolare e di altre regioni dello scheletro. Spesso è associato un ritardo nella crescita.
La funzione del gene TGDS nell'uomo non è al momento nota. La proteina umana presenta una identità di sequenza molto significativa con enzimi batterici e di protozoi patogeni che sono coinvolti nella produzione del L-ramnosio; tuttavia, la produzione di questo zucchero non è mai stata evidenziata nell'uomo. Comunque, l'omologia della sequenza amminoacidica e le caratteristiche cliniche dei pazienti hanno portato a proporre che TGDS possa essere coinvolta nella produzione dei proteoglicani, molecole che contengono zuccheri complessi e che svolgono un ruolo fondamentale nel corretto sviluppo dell'osso e della cartilagine.
Per avere un modello in cui studiare il ruolo di TGDS durante le prime fasi dello sviluppo e comprendere come le mutazioni osservate nei pazienti possono alterare la funzionalità della proteina, abbiamo deciso di utilizzare lo zebrafish come modello sperimentale. Zebrafish presenta numerosi vantaggi: lo sviluppo è esterno e molto veloce e gli embrioni sono trasparenti, quindi possono essere visualizzati direttamente. Inoltre, le prime fasi dello sviluppo dei vertebrati sono abbastanza sovrapponibili: pertanto, da zebrafish è possibile ottenere informazioni importanti anche per i mammiferi.
La prima parte del nostro studio è stata finalizzata a caratterizzare il gene Tgds in zebrafish e l'espressione del RNA messaggero. La proteina codificata dal gene Tgds è stata quindi prodotta come proteina ricombinante e quindi ne sono state analizzate le proprietà. Sono anche stati ottenuti dei mutanti che portano le stesse sostituzioni amminoacidiche osservate nei pazienti, per cercare di capire l'effetto delle mutazioni sulla funzionalità della proteina. La proteina Tgds wild-type ha dimostrato un'attività enzimatica sul substrato UDP-glucosio; questa attività è risultata molto ridotta nei mutanti, confermando che le mutazioni osservate nei pazienti danneggiano la proteina in modo importante.
Questi risultati ci hanno fornito le informazioni fondamentali per poter proseguire nella creazione le modello sperimentale, che verrà sviluppato attraverso l'inattivazione del gene Tgds mediate editing genetico con la tecnica CRISPR-Cas9.
1. Manzke, H. et al. (2008) Catel-Manzke syndrome: two new patients and a critical review of the literature. Eur J Med Genet 51, 452-465. doi: 10.1016/j.ejmg.2008.03.005
2. Ehmke, N. et al. (2014) Homozygous and compound-heterozygous mutations in TGDS cause Catel-Manzke syndrome. Am J Hum Genet 95, 763-770. doi: 10.1016/j.ajhg.2014.11.004
3. Ehmke, N. et al. (2020) Biallelic variants in KYNU cause a multisystemic syndrome with hand hyperphalangism. Bone 133, 115219. doi: 10.1016/j.bone.2019.115219.
4. Gaglianone M. et al. (2022) The L-Rhamnose Biosynthetic Pathway in Trichomonas vaginalis: Identification and Characterization of UDP-D-Glucose 4,6-dehydratase. Int J Mol Sci. 23:14587. doi: 10.3390/ijms232314587.