Myoclonus, Epilepsy and Ragged-Red-Fibers (MERRF) is a mitochondrial encephalomyopathy due to heteroplasmic mutations in mitochondrial DNA (mtDNA) most frequently affecting the tRNALys gene at position m.8344A > G. Defective tRNALys severely impairs mitochondrial protein synthesis and respiratory chain when a high percentage of mutant heteroplasmy crosses the threshold for full-blown clinical phenotype. Therapy is currently limited to symptomatic management of myoclonic epilepsy, and supportive measures to counteract muscle weakness with co-factors/supplements. The aim of the "Cure MERRF" project is to test therapeutic approaches in neuronal models derived from patients, i. e. induced Pluripotent Stem Cells (iPSC)-derived neuronal precursors, differentiated neurons and 3D brain organoids. We first demonstrated in patient fibroblasts that induction of mitochondrial biogenesis, pharmacologically (niacin) or genetically (PGC1-α overexpression) is not sufficient to rescue mitochondrial dysfunction in MERRF cells with high-mutation load. On the contrary, mTORC1 inhibition through a prolonged low-dose rapamycin treatment was efficient in rescuing the energetic defect in both intermediate and high-mutation loads. Thus, rapamycin is a good candidate to be tested in models targeted by MERRF disease. To this aim, starting from Peripheral Blood Mononuclear Cells (PBMCs), we generated iPSCs from two control individuals and two different patients carrying the m.8344 mutation and we checked these cells for pluripotency, nuclear and mitochondrial integrity, and m.8344 heteroplasmy. Unfortunately, for one MERRF patient we obtained only wild type mtDNA iPSCs clones. For the second MERRF patient, we generated 3 clones with different heteroplasmies (2%, 18%, 45% of mutant load) and a wild type syngeneic clone. Lastly, we obtained a third iPSCs clone carrying the m.8344 mutation (30% of mutant load) from Prof. Giulia d'Amati. We are currently developing cortical brain organoids from this latter clone, which will be analyzed at days 70-90 through histoenzymatic, genetic and bioenergetic analyses. Next, this model will be used to test rapamycin as first repurposing strategy.

Curare la sindrome MERRF: dai fibroblasti agli organoidi per accelerare la transizione dalla scienza di base ai trial clinici nelle malattie mitocondriali. Le malattie determinate da mutazioni del DNA mitocondriale (mtDNA) sono individualmente rare, ma complessivamente sono le più frequenti malattie genetiche nell'uomo. Possono colpire sia l'infanzia che gli adulti, andando da forme lievi mono-sintomatiche, che portano a cecità o sordità, a forme devastanti che portano a morte. Dopo 30 anni di studio, sono ora disponibili delle potenziali terapie, tuttavia il maggiore ostacolo per la loro sperimentazione umana rimane l'incapacità di generare modelli animali, a causa delle peculiarità del mtDNA. Questo progetto ha l'ambizione di generare e validare un nuovo modello di malattia, usando la tecnologia innovativa che permette la riprogrammazione di cellule staminali pluripotenti (hiPSCs) dai pazienti, e quindi sviluppare in coltura neuroni e organi miniaturizzati, gli stessi malati nel paziente vivente. Questi mini-organi riproducono le manifestazioni della malattia, permettendo di definire i meccanismi che portano al fenotipo clinico, e in definitiva di sperimentare le terapie. Ci sono due vantaggi principali con questo approccio: primo, viene oltrepassata la difficoltà di generare modelli animali per le malattie associate a mutazioni del mtDNA, secondo, la terapia viene ritagliata sul paziente individuale (medicina personalizzata). La malattia che affrontiamo in questo progetto è la sindrome Mioclono, Epilessia, Fibre-Stracciate-Rosse, anche nota come sindrome MERRF, un paradigma per le cosiddette encefalomiopatie mitocondriali. Sperimenteremo sia la rapamicina, farmaco già approvato per l'uso nell'uomo, che molecole nuove, e la terapia genica. Per quanto riguarda la rapamicina, abbiamo già ottenuto risultati promettenti nei fibroblasti cutanei di pazienti affetti da sindrome MERRF, ottenendo un notevole miglioramento delle funzionalità energetica. Abbiamo inoltre ottenuto iPSCs da due individui di controllo e da tre differenti pazienti MERRF e stiamo attualmente sviluppando i mini-organi cerebrali, che verranno studiati e su cui saranno testate le tre terapie previste.

Capristo M, Del Dotto V, Tropeano CV, Fiorini C, Caporali L, La Morgia C, Valentino ML, Montopoli M, Carelli V, Maresca A. Rapamycin rescues mitochondrial dysfunction in cells carrying the m.8344A > G mutation in the mitochondrial tRNALys. Mol Med. 2022 Aug 3;28(1):90. doi: 10.1186/s10020-022-00519-z. PMID: 35922766; PMCID: PMC9347137.

Myoclonic epilepsy with ragged-red fibers

Epilessia mioclonica con fibre rosse sfilacciate