Genome editing via the CRISPR-Cas9 system is an exciting field of biomedical research which is gaining increasing interest for treatment of several diseases. However, classical genome editing approaches still have limitations, including: i. sequence-specificity, that limits their applicability to diseases with high allelic heterogeneity; ii. inability of the currently available techniques to achieve efficient precise integration of a corrective DNA template in post-mitotic cells. These limitations have thus far hindered development of effective gene editing approaches for several inherited retinal diseases, including the most common form of inherited macular degeneration, Stargardt disease (STGD1), which is due to more than 1200 different mutations in the large retinal-specific ABCA4 gene. Therefore, in this project, we aim to develop novel adeno-associated viral vectors-based genome editing strategies for integration of large templates in ABCA4, to allow correction of multiple mutations with a single therapeutic DNA template. To achieve integration of the template we planned to explore different repair pathways which are active in post-mitotic cells like photoreceptors, the target cells for STGD1 treatment. We have developed candidate sets of AAV-Abca4 vectors, which we show are capable of effectively mediate template integration at the endogenous locus, in vitro, in murine HEPA1-6 cell lines, resulting in Abca4 expression. In vivo evaluation of the efficiency of the developed approaches in the retina of the Abca4 -/- mouse model shows correct donor DNA integration in injected eyes, which effectively results in Abca4 expression. Further evaluation of the therapeutic efficacy of the approaches in Abca4-/- mice is ongoing.
Approcci innovativi di modificazione del genoma per il trattamento della sindrome di Stargardt.
La modificazione genomica tramite il sistema CRISPR-Cas9 è un'area della ricerca biomedica che sta riscuotendo un crescente interesse per molteplici scopi, incluso il trattamento di malattie ereditarie, ed è, pertanto, in una fase di sviluppo molto attiva. Tuttavia, gli approcci di modificazione genomica basati sulla Cas9 finora sviluppati hanno mostrato diversi limiti, che ne restringono l'applicabilità in campo terapeutico. Tra le malattie ad oggi inaccessibili vi sono diverse forme di degenerazione retinica ereditaria, inclusa la forma più comune di degenerazione maculare ereditaria - la sindrome di Stargardt (STGD1), dovuta a più di 1200 diverse mutazioni nel gene ABCA4. Pertanto, obiettivo del presente progetto è di sviluppare nuove strategie di modifica del genoma basate sull'uso del sistema CRISPR-Cas9, che, superando le attuali limitazioni, possano espandere l'applicabilità di questo potente strumento biotecnologico. In particolare, nel corso del progetto, svilupperemo strategie basate sull'uso di vettori virali adeno-associati (AAV) per veicolare la Cas9 e lunghi frammenti di DNA che, a seguito di integrazione nel locus endogeno del gene ABCA4, correggano le porzioni del gene mutate nei pazienti. Tale approccio presenterà il vantaggio di essere efficace indipendentemente dalla mutazione causativa della malattia, e di ottenere, quindi, un singolo agente terapeutico per la correzione di molteplici mutazioni del gene ABCA4. Abbiamo ad oggi sviluppato diverse versioni di vettori AAV-Abca4, che hanno mostrato essere in grado di correggere il gene ABCA4 in modelli in vitro ed in vivo. La valutazione dell'efficacia terapeutica di tali candidati vettori è in corso.