SLC2A1 gene (OMIM138140) encodes the glucose transporter type 1 (Glut1), the unique mediator of glucose uptake in the endothelial cells of the Brain-Blood-Barrier (BBB). Most of the identified variants in SLC2A1 gene cause Glut1 loss-of-function and haploinsufficiency, resulting in the Glut1-deficiency Syndrome (GLUT1DS, OMIM606777), a complex neurologic disorder [1-5]. Although the ketogenic diet is usually effective [6], alternative therapeutic strategies are strongly desirable. In this project, we aim at enhancing the glucose transport into the brain by developing two complementary approaches: (i) upregulating the transcription of wild-type Glut1 by modulating its expression at post-transcriptional level to rescue haploinsufficiency; (ii) increasing in a transient and regulated fashion the permeability of BBB to the paracellular diffusion of glucose by developing inhibitory peptides for Claudin-5 (Cldn5), the main component of the BBB tight junctions (TJs). (i) In silico analysis of the genomic region of SLC2A1 reveals the presence of a natural antisense transcript (SLC2A1-AS1) in a head-to-head divergent orientation, detectable in the different cellular models tested. To investigate its role on SLC2A1 expression, we setup a silencing approach based on the use of specific siRNAs. The 3'Untranslated Region (3'UTR) is also a critical element for mRNA stability, the SLC2A1 3'UTR is well conserved and different consensus sites for microRNA are predicted. We developed tools to investigate the role of 3'UTR in the post-transcriptional regulation of SLC2A1 expression. The results obtained in such heterologous systems will be tested in 2D models of BBB derived from controls and patients' iPSC. (ii) The BBB permeability is regulated by specific TJ-forming proteins, specifically expressed by brain endothelial cells and making paracellular spaces toward the brain impermeable to water and solutes. Among different TJ proteins, Claudins (Cldns) are the mainly responsible for paracellular selectivity, with Cldn5 representing the main player in brain endothelial cells [7,8]. We devoted our efforts to study molecular approaches based on the use of competing peptides to modulate Cldn5 complexes and promoting a transient increase of paracellular permeability. Two families of peptides were investigated: peptides based on variants of the non-toxic C-terminal domain of Clostridium Perfringens enterotoxin (cCPE)[9,10] and peptidomimetics based on the first extracellular loop (ECL1) of Cldn5 (C5C2)[11]. Starting from the existing cCPE and C5C2 sequences, we set up an in silico platform12 for the design of a library of short peptides (<20 aa) for Cldn5 binding modulation. We are screening these peptides and verifying effective binding to the Cldn5 complex and TJs opening in vitro using 2D (Transwells) and 3D (organoids)13 models of the BBB and complementary biochemical, imaging and electrophysiological approaches.

SINDROME DA DEFICIT DI GLUT1: NUOVE STRATEGIE TERAPEUTICHE PER AUMENTARE IL TRASPORTO DI GLUCOSIO ATTRAVERSO LA BARRIERA EMATO-ENCEFALICA. Il gene SLC2A1 codifica per il trasportatore del glucosio di tipo 1 (Glut1), l'unico responsabile del passaggio di glucosio nelle cellule endoteliali della barriera emato-encefalica (BBB). Le varianti identificate nel gene SLC2A1 causano la perdita di funzione di Glut1 e aploinsufficienza, con conseguente sindrome da deficit di Glut1 (GLUT1DS), una patologia neurologica complessa. Sebbene la dieta chetogenica sia generalmente efficace, è auspicabile lo sviluppo di strategie terapeutiche alternative. In questo progetto, miriamo a migliorare il trasporto di glucosio nel cervello con due approcci complementari: (i) aumentare la trascrizione di Glut1 mediante la modulazione della sua espressione a livello post-trascrizionale per correggere l'aploinsufficienza; (ii) aumentare la permeabilità della BBB favorendo la diffusione paracellulare di glucosio sviluppando peptidi inibitori per la Claudina-5 (Cldn5), il componente principale delle giunzioni strette, (Tight Junctions, TJ) nella BBB. (i) L'analisi in silico e nostri saggi molecolari hanno rilevato la presenza di un trascritto antisenso (SLC2A1-AS1) orientato in modo opposto, in diversi linee cellulari. Per studiare il suo ruolo sull'espressione di SLC2A1, abbiamo disegnato un approccio di silenziamento basato sull'uso di specifici siRNA. La regione 3'UTR è un altro elemento critico nella stabilità dell'mRNA, il 3'UTR di SLC2A1 è ben conservato e sono predetti siti di consenso per miRNA. Stiamo inoltre studiando il 3'UTR di SLC2A1 per consentire la modulazione dell'espressionela r di SLC2A1 attraverso piccole molecolae di RNA (miRNA). I risultati ottenuti nei sistemi eterologhi saranno testati nei modelli 2D di BBB, ottenuti da cellule cellulel staminali pluripotenti indotte derivate da controlli e pazienti. (ii) La BBB è regolata dalle TJ, strutture presenti sulle cellule endoteliali che compongono le pareti dei capillari cerebrali. La Claudina 5 (Cldn5), è la principale responsabile della permeabilità paracellulare verso il cervello. I nostri sforzi sono dedicati allo studio di approcci molecolari basati sull'uso di peptidi che siano in grado di regolare l'interazione tra le Cldn5 nelle TJ per permettere il transitorio passaggio di glucosio nel cervello. Sono state studiate due famiglie di peptidi: mutazioni di peptidi basati sul dominio C-terminale dell'enterotossina di Clostr. Perfr. (cCPE) e peptidomimetici disegnati sulla base del primo dominio extracellulare della Cldn5 (C5C2). Partendo dalle sequenze di cCPE e C5C2, abbiamo creato una piattaforma in silico12 per generare una libreria di brevi peptidi volti alla modulazione del legame delle Cldn5. Stiamo studiando la funzione di questi peptidi in modelli in vitro di BBB, 2D (Transwell) e 3D (organoidi)13, utilizzando approcci sperimentali complementari di biochimica, imaging ed elettrofisiologia.

1. Klepper J, et al., 2020. DOI: 10.1002/epi4.12414. PMID:32913944 2. Veneruzzo GM, et al., 2023. DOI: 10.5546/aap.2022-02677.eng. PMID: 36315575 3. Suls A, et al., 2008. DOI: 10.1093/brain/awn113. PMID: 18577546 4. Yang H, et al., 2011. DOI: 10.1002/ana.22640. PMID: 22190371 5. Zaman SM, et al., 2018. DOI: 10.1212/NXG.0000000000000297. PMID: 30588498 6. Schwantje M, et al., 2020. DOI: 10.1002/jimd.12175. PMID: 31605543 7. Amasheh S, et al., 2005. DOI: 10.1007/s00441-005-1101-0. PMID: 16158492 8. Greene C, et al., 2019. DOI: 10.1186/s12987-019-0123-z PMID: 30691500 9. Neuhaus W, et al., 2018. DOI: 10.1016/j.biomaterials.2018.01.028. PMID: 29421550 10. Protze J, et al., 2015. DOI: 10.1007/s00018-014-1761-6. PMID: 25342221 11. Dithmer S, et al., 2017. DOI: 10.1111/nyas.13359. PMID: 28505395 12. Berselli A, et al., 2022. DOI: 10.1021/acschemneuro.2c00139. PMID: 35816296 13. Pisani F, et al., 2022. DOI: 10.1038/s41419-022-05025-y. PMID: 35790716

Glut1 deficiency syndrome

Sindrome da deficit di Glut1