Hyper-IgM1 is a rare X-linked combined immunodeficiency caused by mutations in the CD40 ligand (CD40LG) gene, leading to increased susceptibility to infections, liver disease, and cancer. Median survival is 25 years (1). Haematopoietic stem cell transplantation may be curative, but can be high risk (2). Gene addition is not an option, as faithful recapitulation of gene regulation is required to avoid abnormal lymphoid proliferation (3,4). Having shown therapeutic benefit of correcting T-cells (5), we have been developing a CD4+ T-cell gene editing therapeutic strategy with Cas9 and a donor template.
Comprehensive genome integrity assessment is a fundamental question of gene editing for which there is currently no gold standard. Having previously addressed off-target activity (5), here we characterized genomic modifications of CD4+ T-cells upon gene editing at the target double strand break (DSB), as well as genome-wide. Using custom droplet digital PCR copy number variation assays we found on-target large deletions early after editing with Cas9 and an adenoviral associated virus 6 (AAV6) donor, that progressively disappeared in culture.
For the unbiased assessment of genomic events we initially performed 100-metaphase karyotyping, which was normal. We then assessed the sensitivity of optical mapping, a high resolution restriction map technology, in detecting custom small and large rearrangements. When we applied the technology to edited CD4 T-cells edited with Cas9 and an integrase defective lentiviral donor template (IDLV), we revealed the presence of large the on-target integrations compatible with the presence of trapping events, and template concatemers in up to 21% of cells after enrichment. We did not detect other events shared among the biological replicates, nor others apparently related with previously investigated off-targets (5). Large integrations did not appear to affect the behavior of corrected cells, which expressed functional CD40L with a normal kinetic.
In summary, edited CD4+ T-cells have a reassuring genome integrity profile upon gene editing with Cas9 and IDLV. Large on-target deletions and integrations should be expected and investigated in gene editing settings with a donor template.
La sindrome da Iper IgM 1 è una rara immunodeficienza combinata dovuta a mutazioni del gene CD40LG. Essa è caratterizzata da un aumentato rischio infettivo, neoplastico, e di malattia epatica. La sopravvivenza mediana è di 25 anni (1). Il trapianto di cellule staminali ematopoietiche può essere curativo, ma può essere ad alto rischio (2). La malattia non può essere trattata con approcci convenzionali di terapia genica con vettori integranti in quanto l'espressione non regolata del transgene comporta un rischio linfoproliferativo (3,4). Avendo dimostrato in precedenza il potenziale beneficio terapeutico di correggere i linfociti T (5), abbiamo continuato a sviluppare una strategia di modifica genetica dei linfociti T CD4+ con Cas9 e una cassetta correttiva.
La questione dell'integrità genomica è centrale per lo sviluppo e l'impiego dei prodotti di "gene editing", e non vi è attualmente uno standard di riferimento. Avendo già in precedenza valutato l'attività "off-target" della Cas9, abbiamo valutato gli eventi "on-target" e a livello genomico globale dei linfociti CD4+ modificati. Utilizzando una tecnologia di PCR quantitativa (ddPCR) abbiamo individuato la presenza di delezioni genomiche nelle cellule modificate, che scomparivano progressivamente in coltura.
Per valutare eventi inattesi a livello genomico abbiamo dapprima valutato il cariotipo delle cellule modificate, che è risultato normale. In seguito abbiamo valutato la sensibilità di una nuova tecnologia chiamata "optical mapping" nell'individuare riarrangiamenti genomici di diversa dimensione. Applicando questa tecnologia alle cellule corrette con Cas9 e una cassetta correttiva di vettore lentivirale con integrasi difettiva (IDLV) abbiamo individuato la presenza di integrazioni "on-target" in fino al 21% delle cellule dopo arricchimento. Non abbiamo individuato altri eventi ricorrenti tra i vari replicati biologici o eventi correlabili all'attività "off-target" della nucleasi. Dette integrazioni "on-target" non apparivano inficiare il comportamento delle cellule modificate, in quanto esse esprimevano il CD40LG con cinetica normale ed esso era funzionale.
In conclusione, i linfociti CD4+ geneticamente modificati con Cas9 e IDLV per il trattamento della sindrome da Iper IgM1 hanno un profilo genomico rassicurante. Delezioni e integrazioni anche estese sono possibili in questi contesti e devono essere tenute in considerazione.
1. de la Morena MT et al. Long-term outcomes of 176 patients with X-linked hyper-IgM syndrome treated with or without hematopoietic cell transplantation. JACI. 2017;139:1282-92.
2. Ferrua F et al. Hematopoietic stem cell transplantation for CD40 ligand deficiency: results from an EBMT/ESID-IEWP-SCETIDE-PIDTC Study. JACI. 2019;143:2238-53.
3. Brown MP et al. Thymic lymphoproliferative disease after successful correction of CD40 ligand deficiency by gene transfer in mice. Nat Med. 1998;4:1253-60.
4. Sacco MG, et al. Lymphoid abnormalities in CD40 ligand transgenic mice suggest the need for tight regulation in gene therapy approaches to hyper immunoglobulin M (IgM) syndrome. Cancer Gene Ther. 2000;7:1299-306.
5. Vavassori V, Mercuri E et al. Modeling, optimization, and comparable efficacy of T cell and hematopoietic stem cell gene editing for treating hyper‐IgM syndrome. EMBO Mol Med. 5;13:e13545