X-linked acrogigantism (X-LAG) is the most severe form of pituitary gigantism and is characterized by aggressive growth hormone (GH)-producing pituitary tumors that occur in infants.1 X-LAG is associated with chromosome Xq26.3 duplications (the X-LAG locus typically includes the VGLL1, CD40LG, ARHGEF6, RBMX, and GPR101genes) that lead to massive pituitary tumoral expression of the G protein-coupled receptor GPR101, a novel regulator of GH secretion.2 The mechanism underlying GPR101 over-expression was previously unknown. The genome has recently been shown to be compartmentalized into discrete regulatory units termed topologically associating domains (TADs). TADs are submegabase-size chromatin domains with high levels of internal interaction that are insulated from each other by regions of low interaction (TAD borders).3 TAD insulation, therefore, favors the specificity of enhancer-promoter interactions. Using chromosome conformation capture techniques (Hi-C and 4C-seq), we characterized the normal chromatin structure at the X-LAG locus. We showed that GPR101 is located within a TAD delineated by a tissue-invariant and evolutionary conserved border that separates it from centromeric genes and cis-regulatory elements (CREs). All duplications in X-LAG patients involve GPR101, the strong TAD border, and centromeric sequences. RNA-seq analysis in X-LAG tumors and normal pituitary showed that gene misexpression predominantly affects GPR101. Next, using 4C-seq with GPR101, RBMX, and VGLL1 viewpoints, we showed that the duplications in X-LAG patients disrupt the invariant TAD border and produce ectopic interactions that form a novel chromatin domain (neo-TAD). We identified several pituitary active CREs (six candidate enhancers and two GPR101 promoter sequences) within the neo-TAD and demonstrated that an enhancer located close to RBMX significantly enhanced reporter gene expression in cell lines. At the same time, we showed that the GPR101 promoter permits the incorporation of this new regulatory information both in pituitary and embryonic cells. Currently, we are functionally characterizing the human enhancers using transgenic zebrafish embryos. We already cloned the CREs in a specific vector and injected embryos using a transposon-based system. The F0 founders are now being crossed to generate F1 embryos with stable transgene integration in the genome. Moreover, to identify novel pituitary CREs, we are optimizing ChIP-sequencing experiments for enhancer-associated histone marks using operated human pituitary tumors. In conclusion, our results identify X-LAG as a new TADopathy: to our knowledge the first described in endocrinology. Xq26.3 duplications disrupt the local chromatin architecture by forming a neo-TAD and this rewiring of GPR101-enhancer interaction causes the marked over-expression of GPR101 in X-LAG tumors, which in turn drives tumoral GH hypersecretion and gigantism.

Duplicazioni del gene GPR101 associate ad acrogigantismo legato all'X alterano la struttura della cromatina e portano ad una anormale interazione tra GPR101 e specifiche sequenze regolatorie L'acrogigantismo legato all'X (X-LAG) è la forma più grave di gigantismo ipofisario. L'X-LAG è caratterizzato da tumori ipofisari aggressivi che producono l'ormone della crescita (GH) ed insorgono durante l'infanzia. L'X-LAG è causato da duplicazioni nel cromosoma X che coinvolgono il gene GPR101, portando ad una sua alterata espressione nei tumori dei pazienti. Il meccanismo alla base della sovraespressione di GPR101 era precedentemente sconosciuto. Recentemente è stato dimostrato che il genoma è suddiviso in specifiche unità regolatorie, ovvero domini cromatinici con alti livelli di interazione del DNA che sono isolati l'uno dall'altro da regioni a bassa interazione. I domini cormatinici, perciò, favoriscono la specificità delle interazioni tra i geni e le sequenze regolatrici della loro espressione. Utilizzando tecniche in grado di delineare la conformazione cromatinica, abbiamo caratterizzato la normale struttura della cromatina nella regione del genoma dove è localizzato GPR101. Abbiamo dimostrato che GPR101 si trova isolato all'interno di un dominio cromatinico che lo separa dai geni vicini e da sequenze regolatorie denominate enhancer. Queste sequenze promuovono l'espressione genica, agendo come un "turbo". Successivamente, abbiamo dimostrato che le duplicazioni nei pazienti con X-LAG portano alla formazione di un nuovo dominio della cromatina. Al suo interno, abbiamo identificato sei enhancer attivi nelle cellule ipofisarie e dimostrato la funzionalità di uno di essi usando come modello sperimentale delle linee cellulari. Attualmente, stiamo caratterizzando la funzione degli enhancer mediante la loro iniezione in embrioni di zebrafish. Ciò ci consente di capire in quali organi tali sequenze di DNA siano funzionali. Inoltre, per identificare nuovi enhancer attivi nell'ipofisi, stiamo ottimizzando degli esperimenti partendo da cromatina isolata da cellule tumorali provenienti da pazienti operati per un tumore ipofisario. In conclusione, i nostri risultati identificano l'acrogigantismo legato all'X come una nuova patologia che altera la struttura della cromatina attorno al gene GPR101. Le duplicazioni di GPR101 interrompono l'architettura locale della cromatina portando ad una anormale interazione tra GPR101 e alcuni enhancer, provocando di conseguenza la sua marcata espressione nei tumori ipofisari. Questo evento, a sua volta, porta all'ipersecrezione tumorale di GH e al gigantismo.

1. Trivellin, G., Daly, A.F., Faucz, F.R., Yuan, B., Rostomyan, L., Larco, D.O., Schernthaner-Reiter, M.H., Szarek, E., Leal, L.F., Caberg, J.H., et al. (2014). Gigantism and acromegaly due to Xq26 microduplications and GPR101 mutation. N. Engl. J. Med. 371, 2363-2374. 2. Abboud, D., Daly, A.F., Dupuis, N., Bahri, M.A., Inoue, A., Che- vigne´, A., Ectors, F., Plenevaux, A., Pirotte, B., Beckers, A., and Hanson, J. (2020). GPR101 drives growth hormone hyperse- cretion and gigantism in mice via constitutive activation of Gs and Gq/11. Nat. Commun. 11, 4752. 3. Franke, M., Ibrahim, D.M., Andrey, G., Schwarzer, W., Hein- rich, V., Scho¨pflin, R., Kraft, K., Kempfer, R., Jerkovi?c, I., Chan, W.L., et al. (2016). Formation of new chromatin do- mains determines pathogenicity of genomic duplications. Na- ture 538, 265-269.

X-linked acrogigantism (X-LAG)

Acrogigantismo legato all'X