The improvement of novel sequencing technologies is quickly transforming the scientific investigation and the therapeutic treatments of rare genetic diseases, which research is hampered by the limited cohort of diagnosed patients and by the difficulty to evaluate the effect of Variants of Unknown Significance (VUS). In silico predictors represent the gold standard of clinical entities for the interpretation of mutations identified through sequencing approaches(1). Unfortunately, a high number of them are classified as VUS, leading to wrong diagnoses and inadequate treatment of patients(2). To address this point, MITE (Mutagenesis by Integrated TilEs)(3) is a novel saturation mutagenesis technique that allows to easily test thousands of potentially pathogenic protein variants in a single high throughput biological assay. MITE has already been widely applied in cancer research to study the effect of missense mutations in many oncogenes such as P53(4), PTEN(5), ERK2(6), but its potential in the field of rare genetic diseases has not yet been fully exploited(7). As a proof of principle, we decided to apply it to mutagenize two regions (a portion of the DNA Binding Domain and the SAM domain, known hotspots of EEC- and AEC-Syndrome(8,9)) of P63, a transcription factor which, besides its oncogenic function, is mainly involved in skin development as regulator(10,11). To follow the biological activity of each generated variant, we set up a highly efficient conversion strategy from fibroblasts to keratinocytes-like-cells (through P63-KLF4 induction)(12). By using the specific keratinocytes membrane antigen ITGβ4, we were able to separate the converted and non-converted cells, study the enrichment of each variant in the different populations and rank them according to their pathogenic effect. We finally aim to the development of a functional genomics platform to expand such method to any other disease driving gene. Through this approach, we leverage a specific signature to associate each phenotype to a specific physiological or pathological activity of a certain variant. In conclusion, this tool could represent a milestone in the field of genetic disorders, providing the scientific community a strong (and easy to use) functional tool to explore the molecular bases of rare diseases

Lo sviluppo delle nuove tecnlogie di sequenziamento sta rivoluzionando profondamente la ricerca scientifica e il trattamento delle malattie genetiche rare, la cui ricerca è rallentata dal numero limitato di pazienti e dalla difficoltà di valutare l'effetto delle cosidette varianti di significato incerto (in inglese Variants of Uncertain Significance, VUS). I predittori in silico rapresentano, ad oggi, lo standard di riferimento delle autorità cliniche per l'interpretazione delle mutazioni identificate tramite approcci di sequenziamento . Sfortunatamente, la maggior parte di tali mutazioni sono classificate come VUS, portando ad una diagnosi sbagliata e ad un trattamento del paziente inadeguato. Per risolvere questo problema, il MITEseq è una innovativa tecnica di mutagenesi a saturazione sito-diretta che permette di testare migliaia di varianti potenzialmente patoeniche in un singolo esperimento. Come prova del potenziale di questa tecnica nel campo delle malattie rare, abbiamo deciso di applicarlo per mutagenizzare due regioni (una porzione del dominio di legame al DNA e l'intero dominio SAM) di P63, un fattore di trascrizione che , nonostante un coinvolgimento in alcuni tumori, è principalmente responsabile della regolazione dello sviluppo dell'epidermide. Per valutare l'attività biologica di ogni variante generata con il MITE, abbiamo sviluppato un protocollo di conversione da fibroblast a cheratinociti molto effciiente guidato dall'espressione di P63 e KLF4 (un altro fattore di trascrizione). Utilizzando una specifica proteina di membrana come marker della conversione, abbiamo potuto separare le cellule convertite da quelle non convertite, studiare l'arricchimento di ogni variante nelle due popolazioni e classificarle secondo il loro effetto potenzialmente patologico. Infine, stiamo sviluppando una piattaforma di genomica funzionale che ci permetta di espandere facilmente questo approccio a qualsiasi altro gene-malattia. Attraverso questo approccio, possiamo utilizzare una specifica caratteristica comune ai nostri campioni che ci permette di associare ogni fenotipo osservato ad una specifica attività fisiologica o patologica della specifica variante che testiamo. In conclusione, questo strumento potrebbe rappresentare una pietra miliare nel campo delle malattie genetiche, fornendo alla comunità scientifica una piattaforma solida e facile da applicare per esplorare le basi molecolari delle malattie genetiche rare.

1. Melnikov A, Rogov P, Wang L, Gnirke A, Mikkelsen TS. Comprehensive mutational scanning of a kinase in vivo reveals substrate-dependent fitness landscapes. Nucleic Acids Res. Oxford University Press; 2014;42. 2. McGrath JA. Hay-Wells syndrome is caused by heterozygous missense mutations in the SAM domain of p63. Hum Mol Genet [Internet]. Oxford University Press (OUP); 2001 [cited 2020 Feb 14];10:221-9. Available from: https://academic.oup.com/hmg/article-lookup/doi/10.1093/hmg/10.3.221 3. Van Bokhoven H, Hamel BCJ, Bamshad M, Sangiorgi E, Gurrieri F, Duijf PHG, et al. p63 Gene mutations in eec syndrome, limb-mammary syndrome, and isolated split hand-split foot malformation suggest a genotype-phenotype correlation. Am J Hum Genet [Internet]. Am J Hum Genet; 2001 [cited 2022 Sep 13];69:481-92. Available from: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/11462173/

AEC Syndrome, EEC Syndrome

Sindrome AEC, Sindrome EEC