Ectrodactyly-ectodermal dysplasia-cleft (EEC) syndrome is an autosomal dominant disease caused mainly by point mutations in the TP63 gene, characterized by a triad of ectrodactyly, ectodermal dysplasia and facial clefting together with a wide spectrum of other clinical manifestations (e.g. corneal blindness). Surgery can improve some aspects of patients' lives, but the main unmet medical need remains blindness, caused by corneal opacification due to limbal stem cell deficiency. This project focuses on ex-vivo correction of patients' mutations with an engineered allele-specific CRISPR-nuclease. To this end, we are using a structure-guided mutagenesis approach to engineer CRISPR-nuclease to tackle EEC-causing point mutations. p63mut allele-specific knock-out should allow us to restore normal p63 activity in patient primary human cells. Given that p63 plays a key role in regulating all squamous epithelia and has high homology to p53, it is necessary to maximize the custom-designed nuclease for both editing efficiency and specificity toward the mutated allele only, and to reduce its off-target activity. Since EEC syndrome is a rare disease, we are establishing a biallelic EEC cellular model for the validation of our engineered CRISPR system. The validation of this cellular model will serve as a first step to set up an ex-vivo gene therapy for the corneal damage of EEC patients and to validate this approach in patient's primary cells.
Gene-editing allele specifico mediato da CRISPR-Cpf1 ingegnerizzate per il trattamento delle patologie oculari
nella sindrome da Ectrodattilia-displasia ectodermica-labiopalatoschisi (EEC)
La sindrome EEC è una rara malattia genetica caratterizzata dall'associazione di ectrodattilia ("mano a chela di granchio") e anomalie del palato e di altri tessuti di derivazione ectodermica (tessuto nervoso, tessuti epiteliali di rivestimento e annessi come capelli, unghie, ecc.). La patologia è a trasmissione dominante e nella maggior parte dei casi (oltre il 90%) è dovuta a mutazioni nel gene TP63, che codifica per una proteina (p63) essenziale per lo sviluppo e il mantenimento di diversi epiteli di rivestimento tra cui l'epidermide e l'epitelio corneale. Gran parte dei pazienti con EEC presenta, infatti, difetti corneali legati alla perdita progressiva delle cellule staminali responsabili della rigenerazione costante della superficie oculare, indispensabile per mantenere la trasparenza della cornea e la capacità visiva. Il progetto si propone di studiare un nuovo approccio terapeutico per curare la progressiva opacizzazione della cornea e la perdita di vista che ne consegue (che incide fortemente sulla qualità della vita di questi pazienti e costituisce uno dei sintomi più gravi della malattia) utilizzando un innovativo sistema di editing genetico in grado di correggere il gene malato e ripristinare il corretto funzionamento di p63.
1. Di Iorio E, Kaye SB, Ponzin D, et al. Limbal stem cell deficiency and ocular phenotype in ectrodactylyectodermal dysplasia-clefting syndrome caused by p63 mutations. Ophthalmology. Jan 2012;119(1):74-83. https://doi.org10.1016/j.ophtha.2011.06.044.
2. Celli J, Duijf P, Hamel BC, et al. Heterozygous germline mutations in the p53 homolog p63 are the cause of EEC syndrome. Cell. Oct 15 1999;99(2):143-53. https://doi.org10.1016/s0092-8674(00)81646-3.
3. Barbaro V, Nasti AA, Del Vecchio C, et al. Correction of Mutant p63 in EEC Syndrome Using siRNA Mediated Allele-Specific Silencing Restores Defective Stem Cell Function. Stem Cells. Jun 2016;34(6):1588- 600. https://doi.org10.1002/stem.2343.
4. Hirsch T, Rothoeft T, Teig N, et al. Regeneration of the entire human epidermis using transgenic stem cells. Nature. Nov 16 2017;551(7680):327-332. https://doi.org10.1038/nature24487.