A number of different pharmacological and genetic approaches have been attempting to mitigate or cure mitochondrial disorders. Interesting results have been obtained for improvement of isolated or predominant mitochondrial myopathies, for instance by using the pro-autophagic anti-TORC1 rapamycin (1), activators of the mitochondriogenic PGC1-alpha (2), moderate overexpression of the cristae organizer OPA1 (3), or, as a preliminary result, AAV-conveyed gene replacement (in a model of muscle-specific COX deficiency, unpublished). The main problem remains the penetration of the blood-brain barrier to target nerve cells in the CNS. Leigh disease, a genetically heterogeneous condition characterized by defective mitochondrial bioenergetics, is the most common oxidative-phosphorylation disease in infancy. Leigh's brain lesions are mimicked by the ablation of the mouse respiratory chain subunit Ndufs4-/- (4), which is part of, and crucial for, normal Complex I activity and assembly, particularly in the brains of both children and mice. We previously conveyed the human NDUFS4 gene to the mouse brain using either single-stranded adeno-associated viral 9 recombinant vectors (5) or the PHP.B adeno-associated viral vector (6). Both these approaches significantly prolonged the lifespan of the Ndufs4-/- mouse model but the extension of the survival was limited to a few weeks by the former approach, whereas the latter was applicable to a limited number of mouse strains, but not to primates. We then exploited the recent development of new, self-complementary adeno-associated viral 9 vectors, in which the transcription rate of the recombinant gene is markedly increased and can be applied to all mammals, including humans. Either single intra-vascular or double intra-vascular and intra-cerebro-ventricular injections were performed at post-natal Day 1 (7). The first strategy ubiquitously conveyed the human NDUFS4 gene product in Ndufs4-/- mice, doubling the lifespan from 45 to ≈100 days after birth, when the mice developed rapidly progressive neurological failure. However, the double, contemporary intra-vascular and intra-cerebroventricular administration of self-complementary-adeno-associated viral NDUFS4 prolonged healthy lifespan up to 9 months of age. These mice were well and active at euthanization, at 6, 7, 8 and 9 months of age, to investigate the brain and other organs post-mortem. Robust expression of hNDUFS4 was detected in different cerebral areas preserving normal morphology and restoring Complex I activity and assembly. Nevertheless, an additional series of treated animals from the same strain gave inconsistent results, with several subjects deceased early, similar to untreated peers. We are exploring the possible causes of such inconsistency. In any case, our results warrant further investigation on the translatability of self-complementary-adeno-associated viral 9 NDUFS4-based therapy in the prodromal phase of the disease in mice and eventually humans.

Diversi approcci farmacologici e genetici hanno tentato di mitigare o curare i disturbi mitocondriali. Sono stati ottenuti risultati interessanti per miopatie mitocondriali, ad esempio utilizzando la rapamicina, un inibitore pro-autofagico di mTORC1, attivatori mitocondriogenici di PGC1-alfa, la moderata sovraespressione dell'organizzatore delle creste OPA1 o la sostituzione genica ad opera di AAV ricombinante. Il problema principale rimane la penetrazione della barriera emato-encefalica per colpire le cellule nervose nel SNC. La malattia di Leigh, una condizione geneticamente eterogenea caratterizzata da una bioenergetica mitocondriale difettosa, è la più comune malattia mitocondriale nell'infanzia. Le lesioni cerebrali sono riprodotte dall'ablazione della subunità Ndufs4 della catena respiratoria, che è parte e cruciale per la normale attività e assemblaggio del Complesso I, in particolare nel cervello di bambini e topi. In precedenza, abbiamo veicolato il gene NDUFS4 umano al cervello del topo utilizzando vettori ricombinanti virali adeno-associati AAV9 a filamento singolo o il vettore virale adeno-associato PHP.B. Entrambi questi approcci hanno prolungato significativamente la durata della vita del modello di topo Ndufs4-/- ma l'estensione della sopravvivenza è stata limitata a poche settimane dal primo approccio, mentre il secondo è applicabile a un numero limitato di ceppi di topi, ma non può agire sui primati. Abbiamo quindi sfruttato il recente sviluppo di nuovi vettori virali adeno-associati auto-complementari (sc)AAV9, in cui il tasso di trascrizione del gene ricombinante è notevolmente aumentato e può essere applicato a tutti i mammiferi, compreso l'uomo. Al giorno 1 post-natale sono state eseguite singole iniezioni intravascolari o doppie intravascolari e intracerebroventricolari. La prima strategia ha trasmesso ubiquitariamente il prodotto del gene NDUFS4 umano nei topi Ndufs4-/-, raddoppiando la durata della vita da 45 a ≈ 100 giorni dopo la nascita, quando si sviluppa un'insufficienza neurologica rapidamente progressiva. Tuttavia, la doppia, contemporanea somministrazione intravascolare e intracerebroventricolare di NDUFS4 virale scAAV ha prolungato la durata della vita sana fino a 9 mesi di età. Questi topi erano sani e attivi all'eutanasia, a 6, 7, 8 e 9 mesi di età, per indagare il cervello e altri organi post mortem. L'espressione robusta di hNDUFS4 è stata rilevata in diverse aree cerebrali che preservavano la normale morfologia e ripristinavano l'attività e l'assemblaggio del complesso I. Tuttavia, un'ulteriore serie di animali trattati dello stesso ceppo ha dato risultati incoerenti, con diversi animali deceduti prematuramente, simili ai coetanei non trattati. Stiamo esplorando le possibili cause di tale incoerenza. In ogni caso, i nostri risultati giustificano ulteriori indagini sulla traducibilità della terapia basata su NDUFS4 virale scAAV9 nella fase prodromica della malattia nei topi ed eventualmente nell'uomo.

Civiletto G, et al. EMBO Mol Med. 2018 10:e8799. Cerutti R, et al. Cell Metab. 2014;19:1042-9. Civiletto G, et al. Cell Metab. 2015;21:845-54 Kruse SE, et al. Cell Metab. 2008:312-20. Di Meo I, et al. Gene Ther. 2017;24:661-667 Silva-Pinheiro P, et al. Mol Ther Methods Clin Dev. 2020; 17:1071-1078 Corrà S, et al. Brain. 2022;145:3405-3414

Mitochondrial Complex I deficiency

Deficienza di complesso I mitocondriale