Polyribonucleotide phosphorylase (PNPase) is a trimeric phosphorolytic RNA exonuclease highly conserved from bacteria to human. In humans, PNPase (hPNPase) is located in mitochondria and is implicated in RNA import from cytoplasm, mitochondrial RNA degradation and R-loops processing. Mutations in hPNPase-encoding gene cause diverse diseases ranging from hereditary hearing loss to multisystem oxidative phosphorylation deficiency disorders. Correlation of specific mutations to the protein molecular defects and the clinical symptoms is not an easy task due to the plethora of processes involving hPNPase and the small number of patients and their heterogenous genetic backgrounds. In this work we addressed hPNPase sequence-function correlation in vitro and in a bacterial model generated by expressing in E. coli hPNPase and the disease-linked variants P140L, Q387R, E475G and M745T. Preliminary in vitro data showed that hPNPase binds and degrades ssDNA like its bacterial orthologue. All mutants but M745T had reduced RNA and ssDNA binding, whereas only the Q387R displayed reduced RNA degradation activity. In the E. coli model, hPNPase caused R-loop accumulation and the worsening of phenotypic traits typical of the E. coli Δpnp strain lacking the orthologous EcPNPase. Hundreds of E. coli RNAs were stabilized in presence of hPNPase, with only few transcripts destabilized, suggesting that in E. coli, hPNPase may bind but not degrade the RNA. Strains expressing mutant hPNPases were phenotypically more similar to the Δpnp mutant than to the hPNPase-expressing strain, in agreement with their decreased RNA binding activity observed in vitro. Moreover, R-loop level was reduced in the Q387R and E475G mutants. We are currently testing in a bacterial two-hybrid system whether the mutations interfere with the interaction between hPNPase monomers.

UTILIZZO DEL SISTEMA MODELLO ESCHERICHIA COLI PER LO STUDIO DELLA POLIRIBONUCLEOTIDE FOSFORILASI UMANA La poliribonucleotide fosforilasi (PNPasi) è un enzima trimerico ad attività esoribonucleasica e fosforolitica ed è altamente conservato dai batteri fino all'uomo. Negli esseri umani, la PNPasi (hPNPasi) si trova nei mitocondri ed è implicata nel trasporto degli RNA dal citoplasma, nella degradazione dell'RNA mitocondriale e nel processamento degli R-loop. Le mutazioni nel gene che codifica per la hPNPasi causano diverse malattie, tra cui sordità ereditaria e disturbi multisistemici dovuti a difetti nella fosforilazione ossidativa. Correlare le specifiche mutazioni ai difetti molecolari della proteina e ai sintomi clinici non è facile a causa della moltitudine di processi in cui la hPNPasi è coinvolta, del ridotto numero di pazienti e del loro eterogeneo assetto genetico. Lo scopo di questo lavoro consiste nel correlare, laddove possibile, il difetto molecolare della PNPasi provocato dalle varie mutazioni con la severità delle condizioni patologiche che si determinano nei pazienti. Per questo, abbiamo utilizzato un modello batterico di E. coli che esprime la hPNPasi e le sue varianti patologiche P140L, Q387R, E475G e M745T. Dati preliminari ottenuti in vitro hanno dimostrato che la hPNPasi lega e degrada il DNA a singolo filamento così come il suo ortologo batterico. Tutte le hPNPasi mutanti tranne M745T mostrano una ridotta capacità di legame all'RNA e al DNA a singolo filamento, mentre solo Q387R mostra una ridotta attività di degradazione dell'RNA. In E. coli, l'espressione della hPNPasi causa l'accumulo di R-loop e il peggioramento di fenotipi caratteristici del ceppo di E. coli deleto del gene endogeno (Δpnp). Centinaia di RNA di E. coli risultano stabilizzati in presenza della hPNPasi e solo pochi trascritti destabilizzati, suggerendo che la hPNPasi possa legare ma non degradare l'RNA in E. coli. I ceppi che esprimono le hPNPasi mutate sono fenotipicamente più simili al mutante Δpnp che al ceppo che esprime la hPNPasi, in accordo con la loro ridotta attività di legame dell'RNA osservata in vitro. Inoltre, il livello di R-loop è ridotto nei mutanti Q387R ed E475G. Attualmente stiamo anche testando se le mutazioni possano interferire con la trimerizzazione della hPNPasi tramite un sistema batterico a doppio ibrido.

Mitochondrial diseases, Hereditary hearing loss

Malattie mitocondriali (mitocondriopatie), Sordità ereditaria, Sindrome di Leigh