Duchenne Muscular Dystrophy (DMD) is a severe disease leading to muscle wasting and premature death. DMD is caused by either mutation of the dystrophin gene disrupting the open reading frame or deletions producing a shortened but still functional dystrophin i.e. Becker muscular dystrophy (characterized by a milder phenotype with a later onset)1. Even though most of DMD patients lack completely of the dystrophin protein, the onset and the severity of the pathology can be extremely heterogeneous ranging from the first decade to twenty years of age. Advances in therapeutic approaches increased the survival of DMD patients over time, however the development of new drugs has been challenging due to difficulties in assessing their efficacy. This project proposes a novel method for the identification and the validation of novel blood biomarkers directly linked to the muscle state2. The tool of choice revolves around the generation of a novel transgenic dystrophic mouse model. MDX animals, lacking the dystrophin protein are crossed with animals expressing a mutated methionyl-tRNA synthetase3 (MetRS animals) under the control of a muscle specific Cre-loxP system. In this way, MetRS mice incorporate the artificial amino acid (ANL) in substitution of the natural methionine into elongating peptide chains. The ANL azido group can be used as a chemical tag and makes possible the visualization and the identification of newly synthesized proteins specifically in skeletal muscle fibers through click chemistry-based techniques. Preliminary results showed an efficient labelling in skeletal muscle fibers upon ANL administration. ANL-containing proteins, were both identified through western blot techniques and visualized on muscle cryosections through immunofluorescence. Moreover, combining click chemistry to immunoprecipitation and subsequently Mass Spectrometry analysis we obtained an enrichment of 800-1000 proteins in MetRS mice. The advantage of this tool extends to the ability to monitor labelled proteins secreted from skeletal muscle and circulating through the blood. Analysis of blood serum and liver of these animals, showed indeed an increased amount of labelled proteins in MetRS-MDX mice when compared to wild type confirming the sensitivity of this method and its potentials for the identification of muscle proteins synthesized and secreted in specific time-windows. The identification of muscle proteins in MetRS-MDX blood serum at different time points, in particular at 3 weeks old mice at the first wave of degeneration and once the muscle pathology is well established (at four months) can be used to establish both degeneration biomarkers and how these proteins change in response to treatment or physical exercise4. In conclusion, results coming from MetRS-MDX mouse models will be compared to the serum coming from DMD patients to determine which biomarkers can be used in clinical trials to establish the efficacy of a therapeutic approach.

La distrofia muscolare di Duchenne è una malattia rara ereditaria legata al cromosoma X che porta a progressivo deterioramento dei muscoli scheletrici. I primi sintomi della malattia insorgono nei primi anni di vita, impedendo le normali attività motorie dei pazienti fino ad arrivare a problemi cardiaci e respiratori che risultano il motivo più comune di decesso. Tale malattia è dovuta alla mutazione del gene della distrofina, proteina contenuta nelle cellule muscolari che svolge importanti attività come ancorare la membrana della fibra muscolare alla matrice extracellulare. La perdita della distrofina porta quindi alla morte delle fibre (cellule) muscolari che successivamente vengono sostituite da cellule fibrotiche prive di capacità di contrazione. Sintomi come l'ipostenia e l'atrofizzazione dei muscoli volontari peggiorano progressivamente in concomitanza con la sostituzione del tessuto muscolare con quello fibrotico. Ad oggi la diagnosi viene fatta sulla base di biomarcatori come i livelli di creatinchinasi, un enzima che aumenta fino a 100 volte di più in presenza della malattia, rilevabile dopo l'insorgere dei sintomi. Questo progetto ha come obiettivo principale quello di cercare biomarcatori che permettano una diagnosi molto precoce della malattia e allo stesso tempo permettano di monitorarne il progresso in base al trattamento terapeutico. A questo scopo, nel nostro laboratorio abbiamo creato una linea murina che contemporaneamente simuli la distrofia muscolare ed esprima un enzima modificato capace di far incorporare nelle proteine muscolari un aminoacido sintetico. Questo aminoacido viene inserito nelle proteine in maniera esclusiva a livello delle cellule muscolari, e così può essere usato per identificare biomarcatori che vengono secreti dal muscolo nel circolo sanguigno persino molto prima dell'insorgenza dei primi sintomi. I primi esperimenti hanno dimostrato che questo modello murino è efficace nel visualizzare cosa viene secreto dal muscolo nel siero e conseguentemente quali proteine muscolari arrivano al fegato. Il nostro obiettivo consiste nell'identificare le proteine secrete nel siero del nostro modello murino e confrontarle con quelle di pazienti distrofici per avere una lista di biomarcatori utili per la diagnosi. Infine, i candidati ideali, monitorati in momenti diversi del trattamento, saranno utili per capirne l'efficacia.

1. Vitacca M. Weaning strategies and protocols. Non-invasive Vent Weaning Princ Pract. Published online 2010:543-549. doi:10.1201/b13434 2. Hathout Y, Marathi RL, Rayavarapu S, et al. Discovery of serum protein biomarkers in the mdx mouse model and cross-species comparison to Duchenne muscular dystrophy patients. Hum Mol Genet. 2014;23(24):6458-6469. doi:10.1093/hmg/ddu366 3. Alvarez-Castelao B, Schanzenbächer CT, Langer JD, Schuman EM. Cell-type-specific metabolic labeling, detection and identification of nascent proteomes in vivo. Nat Protoc. 2019;14(2):556-575. doi:10.1038/s41596-018-0106-6 4. Blaauw B, Agatea L, Toniolo L, et al. Eccentric contractions lead to myofibrillar dysfunction in muscular dystrophy. J Appl Physiol. 2010;108(1):105-111. doi:10.1152/japplphysiol.00803.2009

Duchenne Muscular Dystrophy

Distrofia muscolare di Duchenne