Joubert syndrome (JS) is a mostly recessively inherited rare ciliopathy diagnosed by the presence of a unique mid-hindbrain malformation, the "molar tooth sign". Besides the typical neurological signs, JS patients present wide clinical variability, with possible involvement of other organs[1]. Over 40 JS-causative genes are identified and a definite genetic diagnosis is reached only in 60-70% cases. Genotype-phenotype correlations are established only for few genes, and it is still unclear why causative variants in some genes associate to a wide spectrum of phenotypes[2].
This project aims to:
1. Increase the diagnostic yield of JS by searching for cryptic variants in known genes.
2. Improve genotype-phenotype correlates by assessing the pathogenic impact of missense variants (especially "variants of unknown significance").
3. Understand mechanisms underlying the variable phenotypic expression of JS genes by modeling tissue-specific phenotypes in patients' iPSCs.
Aim 1:
We focused on 39 JS patients carrying a single coding pathogenic variant in a known JS gene. We reanalyzed NGS data searching for CNVs and rare intronic variants predicted to impact splicing, identifying 5 intragenic heterozygous deletions in 7 cases and 7 intronic variants predicted to affect splicing in 9. All intronic variants were shown to induce overt splicing defects. To date, this reanalysis detected the "second hit" in 16 patients carrying heterozygous coding variants, demonstrating that cryptic variants are common mutational events in JS.
Aim 2:
Using patients' primary fibroblasts carrying selected variants and KO cell models in which the variant of interest was re-expressed, we assessed cellular phenotypes such as number and morphology of primary cilium, and cilia-related signaling pathways (Shh and Wnt). Upon optimization of the methods, we are currently characterizing the ciliary phenotype from 2 patients' cell lines for each of the 7 major JS genes (CPLANE1, TMEM67, SUFU, KIAA0586, CC2D2A, RPGRIP1L, INPP5E). Meanwhile, the same genes were knocked-out in hTERT-RPE1 cell lines through stable expression of Cas9 and transient transfection of gene-specific sgRNAs; site-directed mutagenesis to insert missense variants in WT plasmids is underway.
Aim 3:
Focusing on CPLANE1, a commonly mutated JS gene which can result in a pure neurological or in a distinctive oral-facial-digital phenotype, we established and characterized iPSCs from 2 CPLANE1 patients and 2 healthy controls. Analysis of cilia number and morphology in patients' cells indicated impaired ciliogenesis. A protocol developing 3D cerebellar organoids from iPSCs was successfully set up to monitor time-related expression of markers of cerebellar development. Comparative analysis of stage-specific neuronal markers in control and CPLANE1 cells is underway using immunofluorescence and qRT-PCR. Design of a 3D mesodermal differentiation protocol is also ongoing to study tissue-specific modulation of CPLANE1 expression.
La sindrome di Joubert: oltre la genetica mendeliana convenzionale.
La sindrome di Joubert (SJ) è una ciliopatia ereditata per lo più in modo recessivo, diagnosticata da una malformazione del mesencefalo, il "segno del dente molare". Oltre ai tipici segni neurologici, i pazienti presentano un'ampia variabilità clinica, con coinvolgimento di altri organi[1]. Sono stati identificati oltre 40 geni causativi della SJ e la diagnosi genetica definitiva viene raggiunta solo nel 60-70% dei casi. Le correlazioni genotipo-fenotipo sono state stabilite solo per pochi geni e non è ancora chiaro perché le varianti causative in alcuni geni si associno a un ampio spettro di fenotipi[2].
Ci proponiamo di:
1. Aumentare la resa diagnostica della SJ attraverso la ricerca di varianti criptiche in geni noti.
2. Migliorare le correlazioni genotipo-fenotipo valutando l'impatto delle varianti missenso.
3. Comprendere i meccanismi alla base dell'espressione dei geni della SJ modellando fenotipi tessuto-specifici in iPSC di pazienti.
1:
Ci siamo concentrati su 39 pazienti con una singola variante codificante in un gene noto. Abbiamo rianalizzato i dati NGS alla ricerca di CNV e di varianti introniche predette alterare lo splicing, identificando 5 delezioni intrageniche in 7 casi e 7 varianti introniche in 9. Tutte le varianti introniche hanno dimostrato di indurre difetti di splicing. Ad oggi, questa rianalisi ha individuato il "secondo hit" in 16 pazienti portatori di varianti codificanti eterozigoti, dimostrando che le varianti criptiche sono eventi mutazionali comuni nella SJ.
2:
Utilizzando fibroblasti di pazienti portatori di varianti selezionate e modelli cellulari KO in cui la variante di interesse è stata riespressa, abbiamo valutato il numero e la morfologia del cilio primario e le vie di segnalazione correlate. Stiamo attualmente caratterizzando il fenotipo ciliare di 2 linee cellulari di pazienti per ciascuno dei 7 principali geni (CPLANE1, TMEM67, SUFU, KIAA0586, CC2D2A, RPGRIP1L, INPP5E). Nel frattempo, gli stessi geni sono stati "knocked-out" in cellule hTERT-RPE1 attraverso l'espressione stabile di Cas9 e la trasfezione transitoria di sgRNA specifici per il gene; è in corso la mutagenesi sito-specifica per inserire varianti missenso nei plasmidi WT.
3:
Concentrandoci su CPLANE1, abbiamo creato e caratterizzato iPSC da 2 pazienti CPLANE1 e 2 controlli sani. L'analisi del numero e della morfologia delle cilia nelle cellule dei pazienti ha indicato un'alterata ciliogenesi. È stato messo a punto un protocollo di sviluppo di organoidi cerebellari 3D da iPSC per monitorare l'espressione temporale dei marcatori dello sviluppo cerebellare. È in corso l'analisi comparativa dei marcatori neuronali stadio-specifici nelle cellule di controllo e in quelle CPLANE1 mediante immunofluorescenza e qRT-PCR. È in corso anche la progettazione di un protocollo di differenziamento mesodermico 3D per studiare la modulazione tessuto-specifica dell'espressione di CPLANE1.
[1] M. Romani, A. Micalizzi, and E. M. Valente, "Joubert syndrome: congenital cerebellar ataxia with the molar tooth," Lancet Neurol, vol. 12, no. 9, pp. 894-905, Sep. 2013, doi: 10.1016/S1474-4422(13)70136-4.
[2] R. Bachmann-Gagescu et al., "Healthcare recommendations for Joubert syndrome.," Am J Med Genet A, vol. 182, no. 1, pp. 229-249, 2020, doi: 10.1002/ajmg.a.61399.