Wilson Disease (WD) is a life-threating autosomal disorder of copper homeostasis caused by mutations in copper transporter ATP7B and characterized by toxic copper accumulation, resulting in severe and progressive liver and brain diseases. WD represents an attractive target for liver-directed gene therapy. However, classic gene replacement strategies hold limitations associated to adeno-associated viral vector (AAV) cargo capacity constraints, decline of therapeutic effect due to transgene dilution and genotoxic risk, particularly in children. We applied a liver-directed nuclease-free genome editing approach, based on AAV-mediated targeted integration of a promoterless ATP7B cDNA into the albumin locus. To this aim, we generated an AAV8 vector bearing a codon-optimized human mini-ATP7B cDNA flanked by two mouse Alb homology arms and preceded by a sequence encoding for a 2A peptide derived from porcine teschovirus-1 (AAV-Alb-mini-ATP7B). Intra-venous injection of AAV-Alb-mini-ATP7B in Atp7b-/- pup and adult mice resulted in a complete rescue of survival. At sacrifice, these mice showed extensive liver repopulation by genome edited hepatocytes, associated to an amelioration of liver injury and rescue of serum ceruloplasmin oxidase activity, compared to Atp7b-/- mice injected with a control vector. Furthermore, we combined promoterless nuclease-free genome editing with the administration of D-penicillamine, a copper chelator currently used for the therapy of WD. Atp7b-/- mice treated with D-penicillamine and AAV-Alb-mini-ATP7B showed a significant improvement of liver pathology and reduction of copper storage compared to Atp7b-/- mice administered with chelation therapy alone. In summary these results indicate that promoterless nuclease-free genome editing provide a significant and sustained therapeutic benefit in WD and may represent a safer alternative to classic gene replacement strategies.
La malattia di Wilson è una malattia genetica del metabolismo del rame, causata da mutazioni del gene ATP7B e caratterizzata da un accumulo tossico di rame, principalmente a carico del fegato e del cervello. Le terapie attualmente disponibili non sono efficaci in tutti i pazienti e presentano effetti collaterali anche gravi, rendendo necessario lo sviluppo di terapie alternative. La malattia di Wilson rappresenta un candidato attraente per la terapia genica diretta al fegato e studi clinici sono tuttora in corso per dimostrarne l'efficacia nei pazienti. La terapia genica classica però presenta diversi limiti in termini di sicurezza e di efficacia a lungo termine, soprattutto per i pazienti in età pediatrica, che ad oggi ne complicano l'utilizzo per la terapia della malattia di Wilson. Nel corso di questo studio abbiamo sviluppato un approccio di editing genomico per la malattia di Wilson, consistente nell'inserimento di una copia del gene ATP7B nel genoma delle cellule del fegato di topi modello della malattia, mediante l'utilizzo di vettori adeno-associati. L'inserimento della copia del gene terapeutico in una specifica regione del genoma garantisce la produzione di alti livelli di ATP7B ristretti alle cellule del fegato, evitando così eventuali effetti tossici legati all'espressione del gene in cellule diverse da quelle bersaglio e all'inserimento casuale del gene nel genoma delle cellule. I topi trattati con l'editing genomico mostravano un completo ripristino della funzione di ATP7B, associato ad significativo miglioramento della malattia epatica e del metabolismo del rame. Inoltre, la terapia si mostrava parimenti efficace quando somministrata in topi che assumevano D-penicillamina, una molecola largamente utilizzata per la terapia della malattia di Wilson, capace di legare il rame e di favorirne l'escrezione urinaria. In conclusione, i risultati derivati da questi studi potrebbero aprire la strada allo sviluppo di una nuova terapia per la malattia di Wilson, che superi le limitazioni delle precedenti terapie.