Distal appendages (DAs) are ninefold pinwheel-like structures protruding from the distal end of the mother centriole. They are essential for the docking of the basal body to the plasma membrane and thus represent an absolute requirement for the formation of the primary cilium. CEP83 is the innermost component in the hierarchical organization of DA proteins and is necessary for the recruitment of all other DA components. As a consequence, CEP83 is required for ciliogenesis. Mutations in CEP83 have been linked to nephronophthisis (NPHP), a genetic disorder in which the formation and function of the primary cilium are affected and thus included in the spectrum of ciliopathies. Despite the known role of CEP83 in the initial steps of ciliogenesis, the pathogenic mechanism of CEP83 mutations still has not been clarified. Considering that ciliogenesis is essential for embryonic development, CEP83-related ciliopathies are most likely arising from a subtle perturbation of ciliary functionality, rather than from a complete abrogation of the role of this protein in the assembly of the primary cilium. To elucidate this phenomenon, we took advantage of our expertise in the CRISPR/Cas9-mediated generation of knock-in cell lines and obtained RPE1 clones bearing CEP83 mutations associated with infantile nephronophthisis. Specifically, we generated homozygote knock-ins for two different mutations that were found in NPHP patients and that are known to affect coiled-coil domains of CEP83. Importantly, we plan to expand our panel of mutations affecting DA proteins and model cell lines as well. In this poster, I will present a preliminary characterization of the structural alterations arising at the level of the DAs in these cellular models by exploiting expansion microscopy. Briefly, we discovered that one of the mutations causes a marked perturbation of DAs and thereby ciliary assembly, with an increasing extent in the loss of the canonical ninefold symmetry when proceeding from the inner to the outer protein components. On the contrary, a second mutation did not display measurable structural alterations, either of DAs or cilia. Considering that DAs are involved in the gating function that governs the transport of cargoes to and from the ciliary compartment, we hypothesize that some ciliopathy DA protein mutations might not impact primary ciliogenesis, but rather alter the ciliary gating. To test this, we are presently establishing efficient ways to express a ciliary-targeted peroxidase (known as APEX2) allowing us to label the ciliary proteome with biotin, followed by mass spectrometry-based protein identification. This will enable us to define an inventory of the ciliary proteome across different isogenic samples. The combination of these approaches will clarify the role of CEP83 in the pathogenesis of NPHP, potentially informing about novel therapeutic strategies for patients suffering from this ciliopathy.

"Studio di una piccola struttura cellulare coinvolta nella patogenesi delle ciliopatie del rene" Il ciglio primario è un organello cellulare simile ad un'antenna e coinvolto nella percezione dell'ambiente circostante. Il suo assemblaggio è garantito dalla presenza di complesse strutture proteiche dette corpi basali. La proteina CEP83 è una componente fondamentale dei corpi basali ed è necessaria alla loro abilità di formare ciglia. Le mutazioni del gene CEP83 possono causare una malattia genetica detta nefronoftisi (NPHP), caratterizzata dalla presenza di ciglia primarie che non funzionano correttamente. Ai fini di comprendere meglio questo fenomeno, abbiamo deciso di analizzare diverse mutazioni di CEP83 trovate in pazienti con NPHP in modelli cellulari che abbiamo sviluppato usando l'ingegneria genetica. Grazie a tecniche di microscopia avanzata, abbiamo avviato degli studi volti a stabilire le alterazioni strutturali sia del corpo basale che del ciglio nelle cellule con CEP83 malfunzionante. Sorprendentemente, una delle mutazioni analizzate causa delle aberrazioni strutturali molto marcate, mentre per un'altra mutazione analizzata non si osservano difetti strutturali visibili. Attualmente ci stiamo concentrando sullo sviluppo di metodi volti a determinare la composizione proteica del ciglio primario nei diversi modelli cellulari. Ipotizziamo infatti che mutazioni a carico di geni del corpo basale possano impattare sulla composizione proteica del ciglio, determinando dunque un malfunzionamento dell'antenna in assenza di suoi difetti strutturali evidenti. Con la nostra ricerca ci riproponiamo pertanto di comprendere i meccanismi con cui le mutazioni dei geni del corpo basale causano NPHP e di creare modelli cellulari per studiare nuovi approcci terapeutici della patologia.

Nephronophthisis, Retinitis pigmentosa

Nefronoftisi, retinite pigmentosa