Background: Cystic fibrosis (CF) is caused by mutations in the gene encoding the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR), a cAMP-activated Cl- channel whose dysfunction leads to respiratory failure. The approval of CFTR modulators has opened the possibility of targeting the basic molecular defects underlying CF. Nevertheless, these molecules fail to completely rescue the activity of CFTR mutants, and patients with rare mutations are not eligible for these treatments. Hypothesis and objectives: We previously identified phosphoinositide 3-kinase γ (PI3Kγ) as a PKA-anchoring protein that tethers PKA to cAMP hydrolysing enzymes, restraining cAMP-mediated activation of CFTR. Accordingly, we conceived a cell-permeable mimetic peptide (PI3Kγ MP) that, by targeting PI3Kγ scaffold activity, increases sub-cortical levels of cAMP, the second messenger known to increase channel activation. Here, we aim at demonstrating PI3Kγ MP as an innovative medicinal product that can be exploited to reinstate the function of rare class III-IV CFTR mutants, either directly or by potentiating the efficacy of approved CFTR modulators. Methods: We will investigate the ability of the PI3Kγ MP to rescue the function of rare CFTR mutants by evaluating CFTR activity in cell lines and primary cells expressing rare class III-IV CFTR variants. Results: Previous experiments from our laboratory indicate that PI3Kγ MP inhibits PI3Kγ-bound phosphodiesterase 4 and drives a localized increase in cAMP responsible for PKA-mediated phosphorylation (S737) and opening of wild-type CFTR. In primary bronchial F508del cells, PI3Kγ MP potentiates Cl- secretion up to 5 and 2 folds when added on top of Orkambi and Kaftrio, respectively. Notably, the peptide also raises the amount of CFTR at the plasma membrane possibly via protein kinase D (PKD1), a key player in cellular trafficking and exocytosis found to be phosphorylated upon PI3Kγ MP treatment. Furthermore, preliminary data revealed that PI3Kγ MP is able to rescue the opening of the R334W CFTR variant, a rare Class III mutant that is currently not eligible for modulator treatment. Measurement of short-circuit currents (ISC) in intestinal organoids bearing the 2184insA and the R334W allele, shows that acute application of PI3Kγ MP induces an increase in CFTR conductance when applied alone or in association with forskolin. Intriguingly, the peptide retains the ability to partially increase ISC even in the presence of a CFTR-inhibitor, suggesting the ability of the compound to trigger Cl- secretion by activating channels that enhance the electrochemical driving force. Conclusions: With this project, we expect to verify that the mechanism of action of PI3Kγ MP, i.e. localized cAMP/PKA elevation in the CFTR compartment, can be exploited i) to directly rescue the activity of rare class III/IV mutants responsive to cAMP stimulation; ii) potentiate the effects of Kaftrio on rare mutants for which this treatment has been approved.
Ripristino dell'attività di mutanti rari del CFTR con un peptide derivato da PI3Kγ che mira alla funzione di ancoraggio della chinasi A
La Fibrosi Cistica (FC) è una patologia causata da mutazioni nel gene che codifica per il CFTR, canale al cloruro attivato dal cAMP la cui disfunzione porta a insufficienza respiratoria.
L'approvazione dei modulatori del CFTR ha aperto alla possibilità di bersagliare i difetti molecolari alla base della patologia. Tuttavia, queste molecole non riescono a ripristinare completamente
l'attività dei mutanti del CFTR, e i pazienti con mutazioni rare non sono eleggibili per questi trattamenti. Ipotesi e obiettivi: Abbiamo dimostrato in precedenza che l'enzima fosfoinositide 3-chinasi γ (PI3Kγ) limita l'attivazione del canale CFTR agendo come "ancora" per PKA. Di conseguenza, abbiamo ideato un peptide permeabile alla cellula (PI3Kγ MP), che bloccando questa funzione di PI3Kγ, aumenta i livelli subcorticali di cAMP, il secondo messaggero noto per indurre l'attivazione del canale. L'obiettivo del progetto è quello di validare PI3Kγ MP come medicinale innovativo che per ripristinare la funzione di mutanti rari del CFTR di classe III-IV, direttamente o potenziando l'efficacia dei modulatori approvati. Metodi: Indagheremo la capacità di PI3Kγ MP di ripristinare l'attività di mutanti rari del CFTR valutando l'attività del canale in linee cellulari e cellule primarie che esprimono varianti rare di classe III-IV. Risultati: Esperimenti condotti nel nostro laboratorio indicano che PI3Kγ MP sia in grado di inibire l'attività della fosfodiesterasi 4 portando ad un aumento localizzato di cAMP responsabile della fosforilazione mediata da PKA (S737) e dell'apertura del wt-CFTR. Nelle cellule bronchiali primarie derivate da pazienti che esprimono il F508del-CFTR, PI3Kγ MP potenzia fino a 5 e 2 volte la secrezione di Cl- quando usato in combinazione rispettivamente con Orkambi e Kaftrio. In particolare, il peptide aumenta anche la quantità di CFTR sulla membrana plasmatica, tramite la proteina chinasi D (PKD1), un attore chiave nel traffico cellulare e esocitosi che risulta fosforilato dopo trattamento con PI3Kγ MP. Inoltre, dati preliminari hanno rivelato che PI3Kγ MP è in grado di ripristinare l'apertura della variante R334W-CFTR, un raro mutante di classe III che attualmente non è idoneo per il trattamento da modulatori. La misurazione delle correnti di cloruro in organoidi intestinali portatori degli alleli 2184insA e R334W, mostra come l'applicazione acuta di PI3Kγ MP promuove l'attività del CFTR da solo o in associazione con forskolina. Curiosamente, PI3Kγ MP conserva la capacità di aumentare le correnti di Cl- in presenza di un inibitore del CFTR, suggerendo l'attività elettrochimica su altri canali. Ci aspettiamo di convalidare il meccanismo di azione di PI3Kγ MP per ripristinare la funzionalità di varianti rare del CFTR; potenziare l'effetto di Kaftrio su mutanti rari per i quali è stato approvato questo trattamento.
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3 Turner MJ, Luo Y, Thomas DY, et al. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 2020;318(5):L908-L920.
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