Major aim of this project is the modeling of 3D muscle structures mimicking two severe muscular dystrophies (MDs): sarcoglycanopathy (LGMDR3-6) and Duchenne muscular dystrophy (DMD) [1]. The generation of such artificial pathological muscles arises from the need of valuable and versatile tools for testing the efficacy of potential drugs, overcoming the lack of underperforming animal models [2, 3], by one side, and posing the bases for future experiments of personalized medicine, on the other side. Nowadays, skeletal muscle tissue engineering represents an emerging and promising field for the production of artificial 3D constructs, which are far superior to 2D cultures in terms of replying complex cellular processes and mirroring muscle architecture and physiological responses. Thus, we propose two well-consolidated strategies for the generation of artificial 3D muscles using immortalized myogenic cells from sarcoglycanopathy and DMD subjects. The first strategy relies on the engraftment of immortalized myogenic cells (from both healthy and dystrophic subjects) on a decellularized extracellular matrix (mouse diaphragm) [4, 5]. While an in-depth characterization of the mouse diaphragm scaffold is still ongoing, we successfully accomplished the re-cellularization with healthy and DMD cells. Conversely, when LGMDR3 myoblasts were used, we observed that cells remained on the surface of the scaffold and scarcely penetrated the matrix. Presently, we are investigating the reason of such different behaviour. The second approach exploits the formulation of a customized bio-ink combining the myogenic cells with biomimetic matrix for biofabricating a 3D artificial muscle model [6, 7]. Through this procedure, we obtained constructs that kept in vitro undergone remodelling and maturation. To improve this process, constructs were maintained under constant tension. After 10/15 days we observed the spontaneous contraction of the muscle engineered tissues (METs). In the supernatant of METs we were able to measure the content of the muscular enzyme creatine phospho kinase (CPK). Of note, the amount of CPK released from LGMDR3 METs maintained under basal conditions was almost double that measured in the supernatant of healthy METs. This was expected considering the genotype of the myoblasts used (MD vs healthy), and strongly suggests that the 3D artificial muscle models faithfully recapitulated the disease phenotypes. Experiments are now planned to set up different conditions of stimulation such as mechanical, electrical or chemical, resembling physio-pathologic occurrences. The reversion of the mutation in LGMDR3 myogenic cells through CRISPR/Cas9 genome editing is undergoing and will allow for final validation of the results in cells sharing identical genetic background. We are confident that the platform under construction, useful for the validation of new compounds, will be versatile and performant, shortening the drug development process in MDs.

MUSCOLI MODELLO 3D DI RARE DISTROFIE MUSCOLARI, UNA POTENTE PIATTAFORMA PER STUDI DI BASE E VALIDAZIONE DI FARMACI Questo progetto mira a creare strutture muscolari 3D che mimano due gravi forme di distrofia muscolare (DM): le sarcoglicanopatie (LGMDR3-6) e la distrofia muscolare di Duchenne (DMD) [1]. Questo scopo nasce dall'esigenza di disporre di strumenti validi e versatili per testare farmaci, superando la mancanza di modelli animali idonei [2, 3] e pone le basi per esperimenti di medicina personalizzata. Ad oggi, l'ingegneria tissutale del muscolo scheletrico è un campo emergente e promettente per la creazione di costrutti artificiali in 3D di gran lunga superiori alle colture 2D sia nella somiglianza dell'architettura muscolare che nelle risposte fisiopatologiche. Proponiamo quindi due strategie ben consolidate per la generazione di muscoli 3D artificiali con cellule miogeniche immortalizzate, provenienti da soggetti con LGMDR3 e DMD. La prima strategia si basa sul trapianto delle cellule (di soggetti sani e distrofici) su una matrice extracellulare decellularizzata (diaframma di topo) [4, 5] che stiamo accuratamente caratterizzando. Nel frattempo abbiamo portato a termine con successo la ricellularizzazione degli scaffold con cellule sane e DMD. Invece negli esperimenti di ricellularizzazione con cellule LGMDR3 abbiamo osservato come le cellule rimanevano sulla superficie dello scaffold e possedevano una bassa capacità di penetrazione nella matrice. Attualmente, stiamo indagando il motivo di tale comportamento. Il secondo approccio sfrutta la formulazione di un bioinchiostro che combina cellule miogeniche con una matrice biomimetica e viene usato per la biostampa di un modello muscolare 3D artificiale (MET) [6, 7]. Attraverso questa procedura abbiamo ottenuto dei costrutti che mantenuti in vitro hanno rimodellato e maturato. Per migliorare il processo, i MET sono stati sottoposti a costante tensione. Dopo 10/15 giorni i muscoli artificiali hanno iniziato a contrarsi spontaneamente. Nel supernatante dei costrutti abbiamo quindi misurato il contenuto dell'enzima muscolare creatinfosfochinasi (CPK). La quantità di CPK rilasciata dai MET LGMDR3 mantenuti in condizioni basali era quasi doppia rispetto a quella dei campioni sani. Questo, previsto considerando il genotipo dei mioblasti utilizzati (DM vs sani), suggerisce con forza che i modelli muscolari 3D ricapitolino fedelmente i fenotipi patologici. Abbiamo programmato esperimenti per testare diverse condizioni di stimolazione (meccaniche, elettriche o chimiche) simili ad eventi fisiopatologici. È in corso la reversione della mutazione nelle cellule malate (LGMDR3) utilizzando l'editing genomico CRISPR/Cas9 che consentirà la convalida finale dei risultati in cellule che condividono lo stesso background genetico. Siamo fiduciosi che questa piattaforma, utile per la validazione di nuovi composti, sarà versatile e promettente, riducendo il processo di sviluppo dei farmaci nelle DM.

1. Mercuri, E., et al. Lancet, 2019. 394(10213): p. 2025-2038. 2. Kobuke, K., et al. Hum Mol Genet, 2008. 17(9): p. 1201-13. 3. Henriques, S.F., et al. PLoS One, 2018. 13(1): p. e0191274. 4. Quarta, M., et al. Nat Commun, 2017. 8: p. 15613. 5. Trevisan, C., et al. Stem Cells Transl Med, 2019. 8(8): p. 858-869. 6. Costantini, M., et al. Front Bioeng Biotechnol, 2017. 5: p. 22. 7. Bach, A.D., et al. J Cell Mol Med, 2004. 8(4): p. 413-22.

alpha-sarcoglycanopathy (LGMDR3/LGMD2D); DMD

alfa-sarcoglicanopatia (LGMDR3/LGMD2D); DMD