Fabry disease (FD) is an X-linked inherited, lysosomal storage disorder caused by mutations in the Alpha Galactosidase-A (GLA) gene encoding for GLA enzyme responsible for catabolism of glycosphingolipids like Globotriaosylceramide (Gb3). Accumulation of Gb3 in lysosomes results in systemic clinical manifestations and reduced lifespan. Enzyme Replacement Therapy (ERT) and chaperone therapy are the available treatments for FD however, noncurative and with limitations.
We developed a potential therapeutic approach based on the permanent genetic modification of hepatocytes to express the hGLA enzyme by targeting the albumin locus in vivo. Juvenile P30 Fabry KO mice were treated with 3.0E13 vg/kg of an AAV8 donor vector containing mAlb homology arms and the hGLA cDNA and were sacrificed 4 months post-treatment. This integrative approach resulted in enhanced plasma GLA activity in treated KO mice compared to untreated wild-type levels. An improved GLA activity was measured in tissues (liver, kidney, and heart) confirming efficient uptake of the enzyme. To increase the gene targeting rate, we performed the nuclease-free approach in the presence of fludarabine, an HR-enhancer drug alongside an independent comparative study with CRISPR/Cas9. Plasma GLA activity was 4-5-fold higher with Fludarabine than donor-only-treated mice. Immunofluorescence analysis showed the absence of Gb3 accumulation in kidneys and Lyso-Gb3 HPLC-Mass spec analysis confirmed a reduction in accumulation. To compare this therapy with available treatments, commercial ERT and AAV-mediated liver gene therapy studies are ongoing.
To test translatability, AAV-LK03 vectors containing hALB homology arms will be tested in tissue culture human liver cell lines, in primary cultures of human hepatocytes, and in humanized mice. This data is inclined toward a promising one-shot therapy using a safer gene-targeting approach to ameliorate FD phenotype.
Terapia per la malattia di Fabry basata nell'editing genetico nel fegato senza l'utilizzo di nucleasi
La malattia di Fabry (FD) è un disordine metabolico legato al cromosoma X, causato da mutazioni genetiche a carico del gene galactosidasi A (GLA). I primi sintomi insorgono precocemente durante l'infanzia (2 anni di vita) e l'adolescenza, e sono caratterizzati dall'accumulo sistemico di glicosfingolipidi nei lisosomi, con una progressiva insufficienza multiorgano, dall'esito in molti casi fatale. I trattamenti disponibili sono la terapia enzimatica sostitutiva (ERT), che consiste nella somministrazione dell'enzima GLA sintetico (prodotto in laboratorio), e la terapia chaperonica, che stabilizza la conformazione dell'enzima mutante. Queste terapie hanno però diverse limitazioni, tra cui lo sviluppo di anticorpi diretti contro l'enzima artificiale, riducendo notevolmente l'efficacia terapeutica, mentre la terapia chaperonica è efficace solo per particolari mutazioni. Inoltre, sono molto costose, all'incirca €200.000 all'anno per un singolo paziente.
Lo scopo della nostra ricerca è modificare permanentemente il DNA degli epatociti, in modo da produrre alti livelli di enzima che possono entrare nel sangue e raggiungere tutti gli organi, convertendo il fegato in una bio-fabbrica. Gli organi ammalati riceveranno l'enzima circolante come avviene nell'ERT. Per dimostrare l'efficacia del trattamento useremo un modello murino della malattia di Fabry che ricapitola molto bene i sintomi umani. Quest'approccio ha portato a una maggiore attività del GLA plasmatico nei topi Fabry trattati rispetto ai livelli presenti nei topi wild-type non trattati. È stata misurata una migliore attività del GLA nei tessuti (fegato, rene e cuore), e una diminuzione rilevante nell'accumulo dei glicosfingolipidi, a conferma dell'assorbimento efficiente dell'enzima e la sua attività enzimatica.
Testeremo la procedura in culture di epatociti umani e poi in topi chimerici che hanno epatociti umani nel loro fegato. Questi risultati saranno molto importanti per dimostrare la fattibilità della potenziale applicazione dell'approccio nell'uomo. I nostri dati preliminari sono molto incoraggianti e ci aspettiamo che questi dati saranno cruciali per supportare l'uso clinico di quest'approccio, riducendo notevolmente i costi e le limitazioni delle terapie disponibili.