Gene therapy with adeno-associated viral (AAV) vectors holds great promise to provide long-term expression of therapeutic transgenes after a single administration. However, some of the outstanding challenges include counteracting gain-of-function mutations which do not benefit from traditional gene replacement therapy, as well as to obtain persistent transgene expression from proliferating tissues, such as newborn liver, given the predominantly episomal nature of AAV DNA. To overcome these limitations, we used genome editing based on CRISPR/Cas9-mediated homology-independent targeted integration (HITI) of a therapeutic transgene. We have developed AAV-HITI to target an autosomal dominant form of Retinitis Pigmentosa due to a prevalent P23H RHO (Rhodopsin) mutation. Using a P23H knock-in mouse model, we show that AAV-HITI efficiently targets photoreceptors in heterozygous mice with preliminary evidence of improvement of the retinal phenotype. In addition, to address the issue of AAV-mediated persistent transgene expression in liver, we have developed AAV-HITI that targets the 3' end of the highly transcribed mouse Albumin (mAlb) locus. Using a mouse model of mucopolysaccharidosis type VI (MPSVI), a severe lysosomal storage disease due to the deficiency of the arylsulfatase B (ARSB) enzyme, we show that neonatal AAV-HITI results in circulating supraphysiological levels of enzyme and phenotypic improvement up to 1 year after delivery. Overall, these results support the application of AAV-HITI for the treatment of diseases affecting different organs that cannot be addressed by traditional AAV gene therapy.

La terapia di sostituzione genica mediata da vettori virali adeno-associati (AAV) è considerata una strategia all' avanguardia nel trattamento delle condizioni ereditare recessive derivanti da mutazioni con perdita di funzione. Questa strategia è meno applicabile per il trattamento di malattie con a trasmissione autosomica dominante, dovute a mutazioni che apportano un guadagno di funzione con effetto tossico. Inoltre, data la natura prevalentemente non integrante dei vettori AAV, l' utilizzo della terapia genica in tessuti altamente proliferanti come il fegato neonatale limita la possibilità di ottenere un'espressione persistente nel tempo di un transgene terapeutico. Per superare queste limitazioni, abbiamo sviluppato un approccio di terapia genica basato sull' integrazione mirata indipendente dall'omologia veicolato da vettori AAV (AAV-HITI) mediante il sistema CRISPR/Cas9 in due tessuti differenti: la retina ed il fegato. Nella retina utilizziamo l'approccio AAV-HITI per trattare una forma autosomica dominante di retinite pigmentosa causata dalla mutazione P23H nel gene della rodopsina in un modello murino della patologia, dimostrando che il nostro sistema è efficiente nei fotorecettori. Nel fegato neonatale, per superare il limite legato alla persistenza del transgene terapeutico in un tessuto altamente proliferante, abbiamo utilizzato l'approccio AAV-HITI per integrare il transgene terapeutico nel locus dell'albumina. Utilizzando il modello malattia della mucopolisaccaridosi di tipo VI, una grave malattia da accumulo lisosomiale dovuta alla carenza dell'enzima arilsulfatasi B, dimostriamo che il trattamento neonatale con AAV-HITI risulta in livelli circolanti suprafisiologici dell'enzima migliorando il fenotipo dei topi trattati fino ad un 1 anno dalla somministrazione. Nel complesso, questi risultati supportano l'applicazione di AAV-HITI per il trattamento di malattie che colpiscono organi differenti e che non possono essere trattate con la tradizionale terapia genica.

Retinitis Pigmentosa, Mucopolysaccharidosis typeVI

Retinite Pigmentosa, Mucopolisaccaridosi di tipo VI