Primary ciliary dyskinesia (PCD) is a rare genetic disorder caused by an alteration in the structure and the movement of cilia. The most recurrent symptoms are respiratory tract infections, situs inversus and infertility. This disease is caused by mutations in at least 50 genes, including SPAG1 and CFAP300 which encode for proteins essential for assembly of dynein arms. The aim of this study is to exploit CRISPR/Cas9-mediated base editing for personalized therapy to treat individuals affected by PCD. First, we created and characterized loss of function mutants of SPAG1 and CFAP300 gene ortologues in the teleost zebrafish, exploiting the CRISPR/Cas9 gene editing technique. Indeed, zebrafish embryos present several organs containing motile cilia, and this makes it an ideal animal model for the study of PCD. Furthermore, most of the genes associated with PCD have an orthologue in zebrafish. The CRISPR/Cas9 ribonucleoprotein complexes, including the endonuclease Cas9 and guide RNAs (crRNA:tracrRNA) targeting the zebrafish orthologs spag1a and spag1b as well as cfap300, have been microinjected into the zebrafish zygotes and the efficacy of induced mutagenesis was verified on mosaic embryos at 48 hours post-fertilization. CRISPANT embryos show phenotypes previously reported for PCD-causing mutations in genes encoding cytoplasmic proteins, including curved body and microcephaly. In addition, we observed altered heart looping in spag1a/spag1b CRISPANT embryos, with increased looping angle, as demonstrated by in situ hybridization using cmcl2 probe. Interestingly, we set up the recording of cilia beating in the olfactory bulbs of zebrafish larvae at 4 days post-fertilization, demonstrating altered frequency of cilia beating in mutant larvae. These results suggest that zebrafish mutants may resemble some features showed by individuals affected by PCD. In addition, we are trying to create in zebrafish the same CFAP300 mutation of a patient affected by PCD setting up the CRISPR/Cas9-derived strategy of base editing using a zebrafish-optimized base editor (zAncBE4max), to create targeted C-to-T base substitution. The system consists of deaminase APOBEC1, Cas9n D10A nickase, two uracil DNA glycosylase inhibitors and a bipartite NLS at both ends. A similar approach has been also tested ex-vivo by transducing patient-derived airway epithelial cells with adeno-associated vectors bearing the base editing system to revert PCD mutations into their wild-type counterparts. In conclusion, CRISPR/Cas9-mediated base editing system would be exploited to generate a zebrafish-based personalized disease model of a PCD patient, to create a sort of "avatar" of individual patients that can be used to draw new targeted therapeutic approaches. On the other hand, it can be used prospectively to correct the specific mutation carried by individuals affected by PCD, paving the way for a personalized therapeutic approach.

La discinesia ciliare primaria (PCD) è una rara malattia genetica causata da un'alterazione della struttura e del movimento delle ciglia, appendici cellulari mobili che rivestono diversi apparati, tra cui quello polmonare. I sintomi più ricorrenti sono le infezioni delle vie respiratorie, inversione degli organi interni come il cuore e l'infertilità. Questa malattia è causata da mutazioni in almeno 50 geni, tra cui SPAG1 e CFAP300, che codificano per le proteine essenziali per l'assemblaggio della componente motrice delle ciglia. Lo scopo di questo studio è di valutare il possibile utilizzo di un nuovo sistema di modificazione genetica mirata denominato "base editing" al fine di identificare una terapia personalizzata per il trattamento di individui affetti da PCD. In primo luogo, abbiamo valutato la possibilità di utilizzare un modello animale a basso impatto etico, il pesce teleosteo "zebrafish" o pesce zebra, al fine di studiare nel dettaglio gli effetti della perdita di funzione dei geni ortologhi di SPAG1 e CFAP300, sfruttando la tecnica di editing genico CRISPR/Cas9. Infatti, gli embrioni di zebrafish presentano diversi organi contenenti ciglia mobili, e questo lo rende un modello animale ideale per lo studio della PCD. Abbiamo osservato che i modelli mutanti mosaico per i suddetti geni, denominati "CRISPanti", mostrano un'alterazione dello sviluppo cardiaco e del battito delle ciglia nel bulbo olfattivo, caratteristiche riconducibili a quelle osservate nei pazienti affetti da PCD. Stiamo inoltre cercando di creare in zebrafish la stessa mutazione di un paziente affetto da PCD utilizzando la tecnica del base editing, per creare una sostituzione nucleotidica mirata. Un approccio simile è stato anche testato ex-vivo trasducendo cellule epiteliali delle vie aeree derivate da un paziente affetto da PCD con vettori virali adeno-associati recanti il sistema di base editing, per intervenire sulle mutazioni responsabili della malattia al fine di ripristinare le sequenze corrette. In conclusione, il sistema di base editing potrebbe permettere in futuro di generare un modello di malattia personalizzato basato su zebrafish, per creare una sorta di "avatar" dei singoli pazienti affetti da PCD che potrebbe essere utilizzato per disegnare nuovi approcci terapeutici mirati. D'altra parte, il sistema di base editing potrebbe essere utilizzato come approccio terapeutico personalizzato, correggendo le mutazioni specifiche presenti in individui affetti da PCD, al fine di ripristinare la corretta struttura e funzione delle ciglia.

Primary Ciliary Diskinesia

Discinesia Ciliare Primaria