SARS-CoV-2 belongs to the coronavirus family, which comprises enveloped viruses with a large, single-stranded, positive-sense RNA genome.
SARS-CoV-2 infection is known to induce huge intracellular membrane rearrangements to sustain its life cycle into the host cell.
We focused our attention on two less characterized steps of SARS-CoV-2 life cycle which are replication organelles (ROs) formation and virion assembly and budding.
The SARS-CoV-2 RO is composed of double membrane vesicles (DMVs) linked to the endoplasmic reticulum (ER) by connectors, but the viral proteins and the host factors involved are currently unknown.
We studied the Nsp3, Nsp4 and Nsp6 role in ROs formation: Nsp3, Nsp4 create specialized DMVs where the viral genome is replicated; NSP6, squeezes the ER compartment promoting the formation of zippered ER membranes as connectors between DMVs and ER.
We hypothesized a novel role of Nsp6 in ER membranes rearrangement and ROs formation: NSP6 acts as a filter of proteins and lipids between DMVs and ER, orchestrates the distribution of DMVs clusters and interacts with DFCP1-Rab18 complex to contact LDs, that fuel the replication in SARS-CoV-2 infection.
Instead, viral assembly takes place at the ERGIC where viral structural proteins (M, N, S and E) and the viral RNA assemble into virions that bud into the ERGIC lumen and traverse the secretory pathway to be released.
We studied the role of the E protein in virion assembly and budding. In addition to its known localization at the ERGIC-Golgi, we found that it is also enriched in intraluminal vesicles (ILVs) of multivesicular bodies (MVBs). ILV biogenesis is topologically equivalent to virion budding, as both are inward budding events. We searched for host cell interactors that might mediate E protein budding into ILVs and found a significant interaction with Syntenin, which is known to promote ILV biogenesis. Importantly, we show that the E protein can recruit Syntenin at the Golgi and that this interaction is functional for the subsequent recruitment of Alix and CHMP4B which are, respectively, an accessory protein and a component of the ESCRT machinery that are required for inward budding. These findings suggest a model in which the E protein recruits Syntenin at the Golgi to activate the Alix-dependent ESCRT pathway allowing the budding of virions into the lumen of the Golgi complex.
Studying the membrane rearrangements induced by viral infection could add new knowledge regarding the key players (proteins, lipid composition) that support membrane curvature and reshaping in physiological and pathological conditions.
RIARRANGIAMENTI DI MEMBRANE NELL'INFEZIONE DA COVID-19
Il SARS-CoV-2 appartiene alla famiglia dei coronavirus, che comprende virus a RNA a singolo filamento.
L'infezione da SARS-CoV-2 induce riarrangiamenti delle membrane intracellulari che sostengono il ciclo vitale del virus nella cellula ospite. Ci siamo focalizzati sulle due tappe meno caratterizzate del ciclo vitale del SARS-CoV-2: la formazione degli organelli di replicazione e l'assemblaggio e la gemmazione del virione.
L'organello di replicazione del SARS-CoV-2 è composto da vescicole a doppia membrana collegate al reticolo endoplasmatico da connettori, ma le proteine virali e cellulari coinvolte sono attualmente sconosciute.
Abbiamo studiato il ruolo di Nsp3, Nsp4 e Nsp6 nella formazione degli organelli di replicazione: Nsp3 e Nsp4 creano le vescicole a doppia membrana dove viene replicato il genoma virale; NSP6 comprime il reticolo endoplasmatico promuovendo la formazione di connettori tra le vesciole e il reticolo endoplasmatico.
Abbiamo ipotizzato un ruolo inedito di Nsp6 che agisce come un filtro di proteine e lipidi tra le vescicole e il reticolo endoplasmatico, organizza la distribuzione dei cluster delle vescicole e interagisce con il complesso DFCP1-Rab18 per contattare le goccioline lipidiche, che alimentano la replicazione nell'infezione SARS-CoV-2.
L'assemblaggio virale avviene invece a livello dell'ERGIC, dove le proteine strutturali virali (M, N, S ed E) e l'RNA virale si assemblano in virioni che gemmano nel lume dell'ERGIC e attraversano la via secretoria per essere rilasciati.
Abbiamo studiato il ruolo della proteina E nella formazione del virione. Oltre alla sua nota localizzazione nell'ERGIC-Golgi, abbiamo scoperto che è arricchita anche nelle vescicole intraluminali degli endosomi. La biogenesi di queste vescicole è topologicamente equivalente alla formazione del virione. Abbiamo cercato le proteine della cellula ospite che potrebbero mediare la localizzazione della proteina E nelle vescicole e abbiamo trovato un'interazione significativa con sintenina, proteina già nota per il suo ruolo nella biogenesi delle vescicole endosomiali. Abbiamo dimostrato che la proteina E può reclutare sintenina nel Golgi che a sua volta recluta Alix e CHMP4B, proteine del macchinario ESCRT, necessarie per la formazione delle vescicole intraluminali. Questi risultati suggeriscono che E possa reclutare sintenina al Golgi per attivare il macchinario ESCRT-Alix, consentendo l'invaginazione dei virioni nel lume del complesso del Golgi.
Lo studio dei riarrangiamenti delle membrane intracellulari indotti dall'infezione virale può essere fondamentale per acquisire nuove conoscenze sulle proteine e sui lipidi responsabili di rimodellare le membrane in condizioni fisiologiche e patologiche.