The thromboxane A2 receptor (TP) plays an essential role in hemostasis by binding thromboxane A2 (TXA2), a platelet agonist and a vasoconstrictor which also regulates endothelial function. There are two isoforms of the receptor, TPα and TPβ, generated by alternative splicing from the TBXA2R gene which show different coupling to G-proteins. While the expression and function of TPα in platelets is well established, that of TPβ is debated. TP-deficiency is an autosomal dominant bleeding disorder caused by variants in TBXA2R. Only 6 variants in few families have been described making this disorder rare and poorly studied. Moreover, the severity of bleeding differs among patients with the same gene variant for unclear reasons. We recently found a novel TBXA2R variant in a woman with a lifelong bleeding diathesis. Patient platelets showed defective response to arachidonic acid, U46619 and U44069, two stable TXA2 analogues, at light transmission aggregometry. Secretion of granules was defective, while granule content was normal. These characteristics oriented towards a TP receptor defect, and in order to confirm the diagnosis we performed PCR and Sanger sequencing of the TBXA2R gene. We found a heterozygous A>T substitution at genomic DNA position 11765 (g.A11765T), a variant not reported in the ExAC nor in the 1000G. This variant has differential effects on the two TP isoforms: in TPα the variant hits the 3' UTR without changes in the aminoacid sequence of TPα; in TPβ the variant position corresponds to the alternative splice site, and the A>T substitution may lead to the loss of TPβ. Accordingly, we found 50% expression of TPβ transcript and protein in patient platelets. Aim of the present project is to shed light on the role of the TBXA2R gene variant as the cause of the rare inherited hemorrhagic disorder TP-deficiency and to elucidate the function of TPβ in platelets and endothelial cells. In particular we will: - investigate the function of the TP receptor encoded by a novel gene variant, assessing its ability to bind ligands and to transduce signals - investigate the ability of the two TPα to generate dimers with the normal or mutant TPβ and to undergo internalization - assess the possible co-inheritance of variants in other genes involved in platelet or in coagulation regulation to explaining the variability of the clinical phenotype - shed light on the impact of TBXA2R variants on endothelial cells function in patient-derived endothelial colony forming cells (ECFCs) The knowledge deriving from these studies may on one side set the basis for the development of personalized treatment approaches for this rare inherited bleeding disorder and on the other open the way to the identification of TPβ as a new target for antiplatelet therapy for atherothrombotic disease.

Impatto di una nuova variante dell'isoforma beta del gene TBXA2R associata ad un disordine della funzionalità piastrinica ed endoteliale I disordini emorragici ereditari sono malattie genetiche che si manifestano clinicamente con sanguinamenti, spontanei o provocati, talvolta gravi e che peggiorano la qualità di vita dei pazienti. Il trombossano è una molecola che agisce da agonista delle piastrine, le cellule che assicurano la funzione emostatica, interagendo con il suo recettore sulla superficie delle piastrine ed attivandole, garantendo così il loro corretto funzionamento e l'arresto di eventuali emorragie. Il difetto del recettore del trombossano è un disordine emorragico ereditario molto raro e di conseguenza poco studiato causato da mutazioni del gene TBXA2R. La sua diagnosi richiede test di laboratorio complessi e non è ancora chiaro se la presenza di una mutazione di TBXA2R sia sufficiente per determinare la tendenza emorragica dei pazienti. Inoltre, esistono due sottotipi del recettore del trombossano, TPα e TPβ, e non si sa se le piastrine posseggano entrambe le forme o solo TPα. Infine, il recettore del trombossano è presente e svolge un ruolo fondamentale anche nelle cellule endoteliali, cellule che tappezzano l'interno dei nostri vasi sanguigni, ma nessuno ha mai studiato se mutazioni del recettore possano danneggiare anche queste cellule. Partendo dallo studio di una famiglia da noi identificata affetta da questa rara malattia genetica, il nostro progetto ha lo scopo di aumentare le conoscenze attuali sul difetto del recettore del trombossano migliorandone la diagnosi, identificando eventuali altre mutazioni genetiche associate che possano contribuire alla tendenza emorragica dei pazienti, e determinando se il sottotipo TPβ del recettore è espresso nelle piastrine. Inoltre studieremo anche se le mutazioni del recettore del trombossano possono avere un impatto sulle cellule endoteliali potenzialmente contribuendo così al sanguinamento dei pazienti.

Thromboxane receptor defect

Difetto del recettore del trombossano