TRPML1 (Transient Receptor Potential cation channel, Mucolipin subfamily 1) is a non-selective cation channel that localizes on the lysosomal membrane and is the principal calcium-release channel in this compartment. TRPML1 activity is involved in many membranes trafficking processes such as lysosome to TGN (Trans-Golgi-Network) retrograde trafficking, autophagosome (AV)-lysosome fusion, lysosome reformation, and lysosomal exocytosis. Mutations in TRPML1 cause Mucolipidosis type IV (MLIV: OMIM 252650), a rare autosomal recessive LSD (lysosomal Storage Disease) characterized by severe intellectual disability, speech deficit, progressive visual impairment leading to blindness, myopathy, and achlorhydria. Recently, some reports described kidney disease and kidney failure in various MLIV patients in the second to the third decade of life. However, the physiological role of TRPML1 in the kidney and the molecular mechanisms involved in kidney defects in MLIV are still unknown. Here we study the role of TRPML1 in kidney function by using in vitro and in vivo models of MLIV.
Histological characterization of kidneys from MLIV mice resulted in the identification of alterations of Proximal Tubular Cells (PTCs) at the level of the Brush Border (BB). Thus, we found a reduction of Periodic Acid of Schiff (PAS) staining and a less-developed BB compared with the preserved apical pole of PTCs from WT mice. Also, the BB marker Ezrin, a protein that plays a structural and regulatory role by stabilizing specialized plasma membrane domains, was delocalized in the cytoplasm compared with the subapical pole localization observed in the BB of WT PTCs. Functionally, we found; a progressive alteration of apical endocytosis characterized by the mislocalization of megalin, a receptor of the Apical-Receptor Mediated Endocytosis (ARME) complex; an impaired fusion of early endosomes; impaired apical recycling; and the swelling of late endosomes/lysosomes. Using proteomics analysis of MLIV mouse urine, we found aberrant excretion of low-weight proteins such as vitamin D-binding protein, Apo-E, and gelsolin. Indeed, immunoblot analysis of MLIV mouse urine confirmed the proteinuria and enzymuria and identified the excretion of albumin, transferrin, retinol-binding protein, and the lysosomal enzymes hexosaminidase, and cathepsins.
Together, our data unveiled a new role of the lysosomal calcium channel TRPML1 in renal function through the modulation of ARME. Most importantly, our observations mechanistically explain kidney disease in MLIV patients and set the bases for developing novel therapeutics to ameliorate kidney phenotype.
ASSENZA DI TRPML1 CAUSA PROBLEMI RENALI IN MODELLO MURINO.
TRPML1 (Transient Receptor Potential cation channel, Mucolipin subfamily 1) è un canale cationico non selettivo che si localizza sulla membrana del lisosoma ed è il principale canale di rilascio del calcio in questo compartimento. All'interno della cellula l'attività di TRPML1 è coinvolta in molti processi di traffico di membrana. Mutazioni in TRPML1 causano la Mucolipidosi di tipo IV (MLIV: OMIM 252650), una rara malattia da accumulo lisosomiale, malattia autosomica recessiva caratterizzata da grave disabilità intellettiva, deficit del linguaggio, progressiva riduzione della vista fino alla cecità, miopatia e acloridria. Recentemente, alcuni rapporti hanno descritto malattie renali e insufficienza renale in vari pazienti affetti da MLIV nella seconda o terza decade di vita. Tuttavia, il ruolo fisiologico di TRPML1 nel rene e i meccanismi molecolari coinvolti nei difetti renali nella MLIV sono ancora sconosciuti. Qui studiamo il ruolo di TRPML1 nella funzione renale utilizzando modelli in vitro e in vivo di MLIV.
La caratterizzazione istologica dei reni di topi MLIV ha portato all'identificazione di alterazioni delle cellule tubulari prossimali (PTCs) a livello della villosità apicale (Brush Border, BB). Abbiamo così riscontrato una riduzione della colorazione con Acido Periodico di Schiff (PAS) e un BB meno sviluppato rispetto al polo apicale conservato delle PTC dei topi controllo. Inoltre, il marcatore della BB, Ezrin, una proteina che svolge un ruolo strutturale e regolatorio stabilizzando domini specializzati della membrana plasmatica, era delocalizzato nel citoplasma rispetto alla localizzazione al polo subapicale osservata nella BB delle PTC controllo. Dal punto di vista funzionale, abbiamo riscontrato una progressiva alterazione dell'endocitosi apicale, caratterizzata da un'errata localizzazione della megalina, un recettore del complesso Endocitosi Apicale Mediata da Recettori (ARME), un'alterata fusione degli endosomi precoci, un alterato riciclo apicale e un rigonfiamento degli endosomi tardivi/lisosomi. Utilizzando l'analisi proteomica delle urine di topi MLIV, abbiamo riscontrato un'escrezione aberrante di proteine a basso peso, come la proteina legante la vitamina D, l'Apo-E e la gelsolina. In effetti, l'analisi immunoblot delle urine di topi MLIV ha confermato la proteinuria e l'enzimuria e ha identificato l'escrezione di albumina, transferrina, proteina legante il retinolo ed enzimi lisosomiali esosaminidasi e catepsine.
Insieme, i nostri dati hanno svelato un nuovo ruolo del canale del calcio lisosomiale TRPML1 nella funzione renale attraverso la modulazione dell'ARME. Soprattutto, le nostre osservazioni spiegano meccanicamente la malattia renale nei pazienti affetti da MLIV e pongono le basi per lo sviluppo di nuove terapie per migliorare il fenotipo renale.