BACKGROUND: Through exome sequencing and subsequent GeneMatcher search, we identified 7 patients from 3 unrelated families carrying biallelic variants (either missense, splice or nonsense) in a novel T-dark gene, FSD1L. Patients feature a neurodevelopmental syndrome characterized by intellectual disability, spasticity, corpus callosum hypoplasia/agenesis, periventricular white matter reduction and mild hydrocephalus. FSD1L encodes a protein highly expressed in the developing and mature brain. Nothing is known about its localization and function, except that it shares 3 conserved domains (CC-COS, FnIII and B30.2/SPRY) and an intrinsically disordered region (IDR), with its paralog FSD1. Moreover, it is highly subjected to alternative splicing, with 8 isoforms annotated, of which one non-coding. METHODS: The impact of one missense variant on splicing was evaluated on patients' RNA. Fibroblasts from three FSD1L-mutated patients and three controls were reprogrammed into induced pluripotent stem cells (iPSCs). These were characterized (karyotype, stemness) and differentiated them towards neural stem cells (NSCs) and, subsequently, neurons. Control and mutant cells underwent a preliminary set of experiments, including: 1) expression profiling of each isoform along neuronal differentiation; 2) whole transcriptome studies on NSCs and neurons; 3) neuronal differentiation and migration assays. RESULTS: The missense variant p.Leu137Val was found to activate a cryptic splice site resulting in a deletion of 37 nucleotides, with subsequent frameshift and insertion of a premature stop codon in all isoforms. No splicing defects were detected in cells carrying the missense variant p.Phe410Val. No RNA decay was triggered by the nonsense variant p.Thr418*. By quantitative RT-PCR with isoform-specific primers, FSD1L isoforms were found to be increasingly expressed along neuronal differentiation in control cells, while expression appeared largely deregulated in all three patients, especially in mature neurons. RNAseq analysis showed a consistent, massive downregulation of several genes encoding transcription factors implicated in embryonic development, as well as members of signaling pathways (e.g. Wnt, TGFβ) and proteins implicated in neuronal migration and axon guidance. Mutant neurospheres were smaller and prone to disaggregation, and premature neurons showed markedly reduced migration ability compared to controls. Finally, when differentiating NSCs towards neurons, mutant cells showed impaired differentiation and significantly increased apoptotic death. CONCLUSION: Our preliminary work confirms that recessive mutations in FSD1L cause a novel neurodevelopment syndrome. FSD1L seems to play a key role in controlling neuronal migration and differentiation and in regulating transcription of key embryonic developmental pathways. The molecular mechanisms leading to such cellular phenotypes are currently being investigated.

BACKGROUND: Attraverso il sequenziamento dell'esoma, abbiamo identificato 7 pazienti di 3 famiglie non imparentate portatori di varianti bialleliche (missenso, splicing o nonsenso) nel nuovo gene, FSD1L. I pazienti presentano una sindrome del neurosviluppo caratterizzata da disabilità intellettiva, spasticità, ipoplasia/agenesia del corpo calloso, riduzione della sostanza bianca periventricolare e lieve idrocefalo. FSD1L codifica per una proteina altamente espressa nel cervello e condivide con il suo paralogo FSD1 3 domini conservati (CC-COS, FnIII e B30.2/SPRY) e una regione intrinsecamente disordinata (IDR). È altamente soggetto a splicing alternativo, con 8 isoforme annotate, di cui una non codificante. METODI: L'impatto di una variante missenso sullo splicing è stato valutato sull'RNA dei pazienti. I fibroblasti di tre pazienti mutati in FSD1L e di tre controlli sono stati riprogrammati in cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC), differenziate in cellule staminali neurali (NSC), poi in neuroni. Queste cellule sono state sottoposte a una serie di esperimenti preliminari: 1) profilo di espressione di ciascuna isoforma lungo il differenziamento neuronale; 2) studi sull'intero trascrittoma di NSC e neuroni; 3) saggi di differenziazione e migrazione neuronale. RISULTATI: La variante missenso p.Leu137Val è risultata attivare un sito di splicing criptico che determina una delezione di 37 nucleotidi, con conseguente frameshift e inserimento di un codone di stop prematuro in tutte le isoforme. Non sono stati rilevati difetti di splicing nelle cellule portatrici della variante missenso p.Phe410Val. La variante nonsenso p.Thr418* non ha innescato alcun decadimento dell'RNA. Mediante RT-PCR quantitativa con primer specifici, le isoforme FSD1L sono risultate sempre più espresse durante la differenziazione neuronale nelle cellule di controllo, mentre l'espressione è apparsa deregolata nei pazienti, soprattutto nei neuroni maturi. L'analisi RNAseq ha mostrato una consistente downregolazione di diversi geni codificanti per fattori di trascrizione implicati nello sviluppo embrionale, nonché membri di vie di segnalazione, come Wnt e TGFβ, e proteine implicate nella migrazione neuronale e nella guida degli assoni. Le neurosfere mutanti erano più piccole e disaggregate e i neuroni prematuri mostravano una capacità di migrazione ridotta rispetto ai controlli. Infine, durante la differenziazione delle NSC verso i neuroni, le cellule mutanti hanno mostrato una differenziazione compromessa e un aumento significativo della morte apoptotica. CONCLUSIONE: il nostro lavoro preliminare conferma che le mutazioni recessive in FSD1L causano una nuova sindrome del neurosviluppo. FSD1L sembra svolgere un ruolo chiave nel controllo della migrazione e della differenziazione neuronale e nella regolazione della trascrizione di percorsi chiave dello sviluppo embrionale. I meccanismi molecolari che portano a questi fenotipi cellulari sono attualmente in fase di studio.

Nerodevelopmental syndrome

Sindrome del neurosviluppo