Mutation of the Sox2 gene causes defective development of multiple brain regions, leading to blindness, mental
retardation, seizures. SOX2, a transcription factor, controls the activity of many genes, some of which are known
to be involved, if mutated, in other neurodevelopmental defects. Understanding the molecular mechanisms of the
brain defects is critical for attempts to develop novel therapies; it requires the knowledge of the roles of the
genes controlled by SOX2. More broadly, identifying genes important for neural cells proliferation and for
neuronal function in general would be important for understanding also other neurodevelopmental disorders, due
to genes unrelated to SOX2, but involved in shared aspects of brain developmental programs.
We identified over a thousand genes controlled by SOX2 by studies in neural cells cultured from neonatal mouse
brain (ref. 1). Many human genes are homologous (roughly speaking, are the human version) to the mouse genes we
identified. Many of them belong to the T-dark gene category, genes of which very little is known, which
represents the focus of this Call. We chose 129 human T-dark genes, prioritizing those whose activity is more
impaired in mouse neural cells in which the SOX2 gene has been eliminated. We assume that the reduced
expression of these genes is likely to affect important neural cells functions. To identify those genes which have
roles in neurodevelopment, we will use a screening procedure, that was recently developed to identify gene
defects leading to microcephaly in humans, and that is based on growing in vitro human brain "organoids"
derived from a previously established cell line. The screening is based on in vitro mutagenesis via the CRISPRCas9
recent methodology, and identifies the mutated genes by genomic sequencing. This technique previously
identified the mutation, in microcephaly, of a gene whose activity can be rescued towards normality by an
available pharmacological agent (ref. 2).
Uno screening con tecnologia CRISPR-Cas9 in organoidi cerebrali umani per identificare nuovi geni "T-dark"
effettori di Sox2 nella patologia di sviluppo neurale
La mutazione del gene SOX2 provoca difetti di sviluppo di più regioni cerebrali, e causa cecità, ritardo mentale,
epilessia. SOX2, un fattore trascrizionale, controlla l'attività di molti geni, alcuni già noti per essere coinvolti, se
mutati, in altri difetti del neurosviluppo. Comprendere i meccanismi molecolari dei difetti cerebrali è critico per
tentare di sviluppare nuove terapie; ciò richiede la comprensione dei ruoli dei geni controllati da SOX2. In senso
lato, identificare geni importanti per la proliferazione delle cellule neurali e la funzione dei neuroni sarà
importante anche per comprendere altre malattie del neurosviluppo, dovute a geni diversi da SOX2, ma coinvolti
in aspetti condivisi dei programmi di sviluppo cerebrali.
Abbiamo identificato oltre mille geni controllati da SOX2 studiando cellule staminali neurali coltivate dal cervello
di topo neonato (ref. 1). Molti geni umani sono omologhi (in parole povere, sono la versione umana) di geni di topo da
noi identificati. Molti appartengono alla categoria dei geni T-dark, dei quali poco è noto, che rappresenta il fuoco
di questo bando. Abbiamo scelto 129 geni umani T-dark, dando priorità a quelli la cui attività è più ridotta in
cellule neurali di topo prive del gene Sox2. Assumiamo che la ridotta attività di questi geni influenzi funzioni
importanti delle cellule neurali. Per identificare geni critici per il neurosviluppo, useremo una procedura di
screening, recentemente sviluppata per identificare difetti genetici che causano microcefalia nell'uomo, e basata
sulla crescita in vitro di "organoidi" cerebrali umani, derivati da una linea cellulare già stabilita. Lo screening usa
la recente tecnologia CRISPR-Cas9 per creare mutazioni in vitro negli organoidi, e identifica i geni mutati
mediante sequenziamento genomico. Questa tecnica ha già identificato la mutazione, nella microcefalia, di un
gene la cui attività può essere riportata verso la norma mediante un farmaco già esistente (ref. 2).
1) Bertolini JA et al. (2019) Mapping the Global Chromatin Connectivity Network for Sox2 Function in Neural
Stem Cell Maintenance. Cell Stem Cell 24, 462-476.
2) Esk PC et al. (2020) A human tissue screen identifies a regulator of ER
secretion as a brain-size determinant. Science 370, 935-941.