In this project, we compensate for CACNA1A loss-of-function mutations, which underlie neurological disorders, such as episodic ataxia type 2 and absence epilepsy, by regulating the expression of splice variants of a related gene, CACNA1B. Our approach is effective in rescuing electrophysiological and behavioral abnormalities in human iPSC-induced neurons and Cacna1a-deficient mice.
A deficiency in CACNA1A, which encodes the P/Q-type calcium channel CaV2.1, up-regulates the expression of CACNA1B, encoding the related N-type calcium channel CaV2.2. Despite this compensation, the complex neurological profile of CaV2.1 loss-of-function mutations arises, partly because CaV2.2 is not as effective as CaV2.1 in supporting neuronal communication.
We have previously shown that a conserved splicing event, generating two major alternative variants for both CaV2.1 and CaV2.2, regulates the efficacy of both channel types. However, the brain levels of the more effective variant for neuronal communication (EFa) are high enough only for CaV2.1. We reasoned that CaV2.2 would compensate more effectively for CaV2.1 if we could increase the abundance of its EFa variant.
To this end, we have developed a CRISPR/Cas9-mediated genome editing strategy to selectively increase the neuronal abundance of the CaV2.2 EFa variant. Our approach is extremely effective in rescuing network excitability defects of human iPSC-induced neurons carrying CACNA1A loss-of-function mutations, and electrophysiological and behavioral abnormalities of CaV2.1-deficient mice.
Because we leverage a general up-regulation of CaV2.2, rather than targeting individual CaV2.1 mutations, our approach is designed to develop a gene therapy suitable for all CaV2.1 loss-of-function mutations.
Regolazione dello splicing alternativo dei canali calcio mediante editing del genoma come terapia genetica multiuso per le mutazioni CACNA1A con perdita di funzione
In questo progetto compensiamo le mutazioni con perdita di funzione del gene CACNA1A, che sono alla base di disturbi neurologici quali l'atassia episodica di tipo 2 e l'epilessia con assenza, andando a regolare l'espressione delle varianti di splicing di un gene correlato, CACNA1B. Il nostro approccio è efficace nel correggere le anomalie elettrofisiologiche e comportamentali di neuroni indotti da cellule iPS umane e di topi con ridotta espressione di Cacna1a.
Una carenza di CACNA1A, che codifica per il canale del calcio CaV2.1 di tipo P/Q, aumenta l'espressione del gene correlato CACNA1B, che codifica per il canale del calcio CaV2.2 di tipo N. Nonostante questa compensazione, il complesso profilo neurologico delle mutazioni con perdita di funzione di CaV2.1 emerge, in parte perché CaV2.2 non è efficace quanto CaV2.1 nel supportare la comunicazione tra neuroni.
Abbiamo precedentemente dimostrato che un evento di splicing conservato, che genera due principali varianti alternative sia per CaV2.1 che per CaV2.2, regola l'efficacia di entrambi i tipi di canale. Tuttavia, i livelli cerebrali della variante più efficace per la comunicazione tra neuroni (EFa) sono sufficientemente alti solo per il canale CaV2.1. Abbiamo pensato che CaV2.2 potrebbe compensare più efficacemente per CaV2.1 se riuscissimo ad aumentare l'abbondanza della sua variante EFa.
A tal fine, abbiamo sviluppato una strategia di editing del genoma mediata da CRISPR/Cas9 per aumentare selettivamente l'espressione neuronale della variante EFa di CaV2.2. Il nostro approccio è estremamente efficace nel correggere anomalie elettrofisiologiche e comportamentali di topi con ridotta espressione di CaV2.1 e difetti di eccitabilità di neuroni indotti da cellule iPS umane con mutazioni con perdita di funzione in CACNA1A.
Poiché sfruttiamo un aumento di espressione di CaV2.2, piuttosto che cercar di correggere singole mutazioni in CaV2.1, il nostro approccio si presta allo sviluppo di una terapia genica adatta a tutte le mutazioni con perdita di funzione di CaV2.1.
Atassia episodica di tipo 2