Fabry disease (FD) is a lysosomal storage disorder due to a deficiency of α-galactosidase A (GLA) that results in
progressive accumulation of globotriaosylceramide (Gb3) within lysosomes. The classic FD form is more severe,
multisystemic, and appears in childhood. The non-classic or later-onset FD form generally manifests after age 30
and has milder symptoms. The over 1,000 variants of GLA identified are generally classified according to their
pathogenicity, although for the group of Variants of Uncertain Significance (VUS) the classification is still very
challenging and a matter of debate.
The reasons underlying these uncertainties are manyfold, but two major ones are the limits of the currently used
test to measure GLA enzymatic activity, and, of course, the different genetic background that may impinge on
"cell-autonomous modifiers" (affecting the ability of a given GLA mutant to act on Gb3) or on "tissue modifiers"
(affecting the response of the target tissues). The GLA activity assay is presently performed under artificial
conditions, using, at best, leukocyte lysates or plasma and with artificial substrates and does not fully reflect the
actual ability of GLA to act on its endogenous substrate in its native environment, the lysosome. With this project
we will exploit our knowledge and the molecular and cellular arsenal we have developed over the years to study
Gb3 metabolic and cellular flux, to set up assays that can assess in intact cells the ability of the GLA variants to
act on Gb3, and to follow the localization and activity of the same GLA variant in cells from patients carrying the
same VUS but with different clinical manifestations. The cell-based assays developed thanks to this seed grant,
once developed to a higher scale, may integrate the in vitro enzymatic activity assays in the diagnostic toolkit for
FD on the one side, and, on the other, may provide hints on cell autonomous modifiers that affect the localization
and activity of GLA variants.
Saggi cellulari per valutare l'attività di varianti di significato incerto di GLA
L'enzima α-galattosidasi A (GLA) degrada un grasso noto come Gb3 nel lisosoma (la centrale degradativa
delle nostre cellule). Quando GLA è assente o non funziona bene, a causa di mutazioni nel gene GLA, Gb3 non
può essere degradato e si accumula nei lisosomi delle cellule creando danni agli organi e ai tessuti. Questa
condizione è chiamata malattia di Fabry. La severità della malattia e la gravità dei sintomi dipendono da vari
fattori, tra cui il tipo di mutazione. Sono stati identificati più di 1000 tipi di mutazione di GLA. Alla maggior parte di
esse è già stata associata la severità dei sintomi, ma per alcune, chiamate Varianti di Significato Incerto (VUS),
tale associazione è controversa o sconosciuta e ulteriori studi sono necessari per la loro classificazione. Una
delle ragioni di tali controversie si può trovare nel tipo di saggio usato per misurare l'attività dell'enzima GLA che
usa condizioni molto artificiali che non riflettono l'effettiva capacità di GLA di agire su Gb3 nel lisosoma. Noi
proponiamo di sviluppare saggi cellulari che misurino la capacità delle varianti di GLA di raggiungere la loro
sede naturale, il lisosoma, e di agire su Gb3 nel lisosoma. Una volta miniaturizzati e automatizzati questi saggi
potrebbero diventare parte dell'armamentario diagnostico per la malattia di Fabry ed il nostro laboratorio, grazie
anche al servizio di screening del TIGEM, potrebbe diventare il centro di riferimento per questi saggi per le
famiglie italiane.
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