The NPC1 gene encodes for an intracellular cholesterol transporter located in the endosomal/lysosomal membrane, which is involved in the mobilization of endocyted cholesterol to the cytoplasm. Mutations of the NPC1 gene lead to massive accumulation of cholesterol and sphingolipids in lysosomes, causing a severe and invariably fatal disorder, called Niemann-Pick type C1 disease.
Cellular alterations associated to the loss of function of the NPC1 protein affect the integrity of lipid enriched plasma membrane microdomains (lipid rafts) and the endocytic pathway, which play a paramount role in viral recognition and entry within the cell. Therefore, altering NPC1 activity or expression is supposed to generate an intrinsic unfavorable host environment for SARS-Cov2, the coronavirus responsible for the recent COVID-19 pandemic. This is because the angiotensin-converting enzyme 2 (ACE2) and type 2 serine transmembrane protease (TMPRSS2) localize in lipid rafts and, by mediating the recognition and priming of the envelope's Spike (S) protein, are crucial for the entry of SARS-Cov2 into the host cells. Thereafter, the activation of clathrin-/caveolae-dependent endocytic pathway allows viral nucleocapsid cleavage and genome RNA release in the cytoplasm, where replication occurs.
To investigate this issue, we used S-expressing pseudotyped lentiviral particles to transduce three different cell lines that are susceptible to SARS-Cov2 infection, following NPC1 activity inhibition or NPC1 expression abrogation by CRISPR-Cas9 editing. Our results indicate that viral infection is reduced by 50% in cells treated with the NPC1 inhibitor U18666A and completely abolished in NPC1 knockout (KO) cells. Notably, by mixing cells that express wild-type (wt) NPC1 with NPC1 KO cells we demonstrated that viral entry is dependent on the activity of the cholesterol transporter NPC1, as indicated by S expression, detected by immunofluorescence, limitedly to cells expressing wt NPC1.
Notably, although interfering with NPC1 activity or expression did not alter the expression levels of TMPRSS2 and ACE2, it determines the localization of ACE2 to the intracellular vesicular compartment reducing its content at the plasma membrane. In particular, while in NPC1 wt cells ACE2 shares its localization between plasma membrane and endosomal vesicles, in cells wherein NPC1 is inactive or ablated, ACE2 is engulfed in LC3B-positive autophagosomes. This finding provides a mechanistic underpinning for the observed cell resistance to infection.
La proteina NPC1 media l'infezione da SARS-Cov-2
Il gene NPC1 codifica per una proteina coinvolta nel trasferimento del colesterolo endocitato dal lisosoma al citoplasma. Mutazioni nella sequenza di tale gene causano l'accumulo di colesterolo e sfingolipidi all'interno del lisosoma, tipico di una grave malattia genetica rara, nota come malattia di Niemann Pick di tipo C.
SARS-Cov2 e altri virus sfruttano i macchinari e meccanismi della cellula ospite per produrre nuove particelle virali che, una volta rilasciate, perpetrano l'infezione ad altre cellule. Il danno cellulare associato alla perdita di funzione di NPC1 include alterazioni dell'integrità di specifici microdomini della membrane plasmatica particolarmente ricchi in colesterolo, le cosiddette "zattere lipidiche", che svolgono un ruolo fondamentale nel riconoscimento e nell'ingresso di molti virus all'interno della cellula. Per tale motivo, noi abbiamo ipotizzato che l'alterazione dell'attività o dell'espressione di NPC1 generasse un ambiente ospite intrinsecamente sfavorevole per il SARS-Cov2, il coronavirus responsabile della recente pandemia COVID-19. Questo proprio perchè l'enzima di conversione dell'angiotensina 2 (ACE2) e la proteasi transmembrana TMPRSS2 si localizzano nelle zattere lipidiche e, mediando il riconoscimento e l'attivazione della proteina Spike (S) del virus, sono cruciali per l'ingresso di SARS-Cov2 nelle cellule ospiti.
Per dimostrare la nostra ipotesi, abbiamo effettuato l'inattivazione funzionale della proteina NPC1 con un farmaco specifico o ne abbiamo abolito l'espressione mediante editing genetico in tre diversi tipi di cellule, nelle quali abbiamo quindi analizzato la risposta all'infezione da SARS-Cov2. I nostri risultati indicano che l'infezione virale è ridotta del 50% nelle cellule trattate con l'inibitore di NPC1 U18666A e completamente abolita nelle cellule NPC1 knockout (KO). Inoltre, mescolando cellule in grado di esprimere una proteina NPC1 funzionale e cellule NPC1 KO, abbiamo dimostrato che l'ingresso del virus dipende strettamente dall'attività di NPC1. Infatti, esperimenti di immunofluorescenza hanno confermato l'espressione di S esclusivamente nelle cellule che esprimono NPC1 wt.
Abbiamo anche caratterizzato i meccanismi responsabili di tale effetto, dimostrando una ridotta espressione delle due proteine, ACE2 e TMPSSR2, nelle porzioni della membrana plasmatica ricche di lipidi dove esse sono normalmente localizzate e dove svolgono un ruolo cruciale nel riconoscimento e l'ingresso del virus nelle nostre cellule.