Background and Rationale: Altered store-operated Ca2+ entry (SOCE) - a mechanism that allows recovery of extracellular Ca2+ during prolonged muscle activity via Ca2+ entry units (CEUs) (1) - causes debilitating disorders including Tubular Aggregate (TA) myopathy. TA myopathy (TAM) (2) is a rare disease linked to mutations in STIM1, Orai1, and CASQ1, and characterized by muscle pain, cramping, weakness, and presence of TAs. The mechanisms linking human mutations to SOCE dysfunction, dysregulation of Ca2+ homeostasis, and finally to development of TAM are still unknown. Summary of Main Results collected: SA1: Which mechanisms underlie assembly of additional CEUs during exercise? The mechanisms underlying the exercise-dependent remodeling of SR and TT leading to CEU assembly are unknown. Here, we first verified that CEUs can assemble ex-vivo (in absence of blood supply and innervation) and then found that higher temperature (36°C vs. 25°C) and lower pH (7.2 vs. 7.4) strongly promotes formation of CEUs. SA2: Are sex hormones involved in the preferential accrual of Tubular Aggregates in male mice? TAs form spontaneously during sedentary ageing in fast twitch fibers of male mice (3). We first demonstrated that regular exercise (which activates SOCE) significantly reduces formation of TAs; then we verified that TAs formation is significantly reduced in muscles of mice treated with: i) 17β-estradiol (E2, at the final concentration of 440 ng / ml H2O in the drinking water); or ii) N-acetylcysteine (NAC at the concentration of 1% w/v), which has anti-oxidant properties. SA3: Do expression of the Orai1-G98S and CASQ1-D44N mutations in knock-in mice result in TAM? In collaboration with R. T. Dirksen (University of Rochester, NY), we have generated two knock-in mice expressing: i) Orai1-G98S, a gain-of-function mutation linked a severe form of TAM (4); ii) CASQ1-D44N, a loss-of-function mutation also linked to a form of TAM (5). The Orai1-G98S mutation resulted in muscle weakness, impaired SOCE and formation of TA both in male and females mice, which could be reduced by voluntary running. The CASQ1-D44N causes a mild (in males) and later onset (in females) phenotype, substantially different from that of G98S mice, i.e. structurally more similar to a vacuolar myopathy. SA4: Which mechanisms are triggered by CASQ1 mutations in Tubular Aggregate Myopathy? To analyze the functional alteration of CASQ1 mutation on Ca2+ homeostasis, we expressed WT and 3 CASQ-1 mutant proteins (D44N, G103D, I385T) found in four patients with TAM in FDB muscle of CASQ1 knockout mice (6). Transfection of CASQ1WT increased the intracellular Ca2+ content while a significant lower increase was observed in fibres expressing mutant CASQ1. In addition, expression of mutant CASQ1 induced a constitutively higher active Ca2+ entry compared to CASQ1WT. More recently we identified causative mutations in RYR1 in patients with TAM, thus adding RYR1 to the list of TAM causative genes.

Titolo: Ruolo di SOCE nella Miopatia degli Aggregati Tubulari. La funzione del muscolo è controllata dai livelli intracellulari di Calcio. L' ingresso di Calcio (Ca2+) controllato dalle riserve intracellulari (SOCE) è un meccanismo attivato durante l'attività prolungata che permette al muscolo di recuperare il Ca2+ esterno e limitare la fatica. Due sono le proteine principali implicate nella funzione di SOCE (STIM1 ed Orai1), il cui accoppiamento durante la fatica permette il recupero del Ca2+ extracellulare. Recentemente anche la proteina Calsequestrina-1 (CASQ1) è stata proposta come importante modulatore della funzione di SOCE. Mutazioni in STIM1, Orai1 e CASQ1 (queste ultime identificate nei nostri laboratori) sono state trovate in pazienti affetti da Miopatia degli Aggregati Tubulari (TAM), una malattia del muscolo caratterizzata da insorgenza di crampi, debolezza muscolare e da presenza di aggregati tubulari, ordinati accumuli di tubuli che originano da rimodellamento del reticolo sarcoplasmatico, che è il sistema che immagazzina il Ca2+ all'interno delle fibre. I meccanismi che legano le mutazioni in STIM1, Orai1 e CASQ1 alla formazione degli aggregati tubulari e a disfunzione muscolare sono ancora sconosciuti. Lo scopo principale del nostro progetto è quello di capire quali meccanismi legano la disfunzione di SOCE causata da mutazioni coinvolte all'alterazione dei meccanismi che regolano il Ca2+ intracellulare, e allo sviluppo della TAM. Per fare questo: a) stiamo studiando gli aggregati tubulari in topi maschi anziani, da laboratorio i quali sviluppano una forma benigna della malattia degli aggregati tubulari b) abbiamo anche sviluppato modelli animali di TAM esprimendo due mutazioni umane, una in Orai1 ed una CASQ1 (rispettivamente Orai1-G98S e CASQ1-D44N), mutazioni identificate in pazienti affetti dalla miopatia; c) stiamo esprimendo mutazioni di CASQ1 identificate in pazienti in modelli cellulari per comprendere le basi molecolari della disfunzione associata alla loro espressione. I dati che stiamo collezionando nei nostri due laboratori, solo in parte già pubblicati, promettono di avanzare la comprensione dei meccanismi alla base dello sviluppo della miopatia TAM nell'uomo. I nostri risultati suggeriscono che la formazione degli aggregati tubulari è associata ad una condizione in cui la funzione di SOCE è depressa. Nei modelli animali, sia in topi anziani che in quelli portatori di mutazione nella proteina Orai1, siamo infatti riusciti a ridurre la formazione degli aggregati tubulari mantenendo SOCE attivo con l'esercizio fisico eseguito giornalmente dagli animali. Abbiamo osservato inoltre che gli aggregati sembrano formarsi maggiormente nelle fibre dei topi maschi e che gli estrogeni sembrano ridurre la loro formazione. Stiamo infine anche valutando l'azione di agenti antiossidanti somministrati nella dieta e nell'acqua e i risultati preliminari sembrano essere promettenti.

1. Protasi et al. Calcium Entry Units (CEUs): perspectives in skeletal muscle function and disease. J. Mus. Res. Cell Motil. 2(2):233-249. 2. Pierobon-Bormioli et al. Familial neuromuscular disease with tubular aggregates. Muscle and Nerve. 1985; 8(4):291-298. 3. Boncompagni et al. Sequential stages in the age-dependent gradual formation and accumulation of tubular aggregates in fast twitch muscle fibers: SERCA and calsequestrin involvement. Age (Dordr). 2012; 34(1):27-41. 4. Endo et al. Dominant mutations in ORAI1 cause tubular aggregate myopathy with hypocalcemia via constitutive activation of store-operated Ca2+ channels. Hum Mol Genet. 2015; 24(3):637-648. 5. Barone et al. Identification and characterization of three novel mutations in the CASQ1 gene in four patients with TAM. Hum Mutat. 2017; 38(12):1761-1773. 6. Vattemi et al. RYR1 mutations in two patients with TAM. Eur J Neurosci. 2022; 56(3):4214-4223.

Tubular Aggregate myopathy

Miopatia degli Aggregati Tubulari