Rett syndrome (RTT)(OMIM #312750) is a severe neuro-developmental disorder commonly caused by heterozygous loss-of-function mutations in the X-linked gene MECP2, encoding the epigenetic reader, methyl-CpG-binding protein 2 (1). Among all pathogenic variants, eight single nucleotide changes account for ~70% of all identified variations(2). Importantly, while loss of MeCP2 function causes RTT, locus duplication also causes a severe neuro-developmental disorder, MECP2 duplication syndrome (MDS)(3), suggesting that MECP2 is a dosage-sensitive gene, with both loss and gain of function causing disease(4). Despite early clinical trials have shown some therapeutic promise, no disease-modifying drugs are currently available(5). On the other hand, innovative approaches based on gene therapy, genome or RNA editing have been developed and provided promising results(6, 7). However, several issues which still need to be addressed prevented their further therapeutic development. In this pioneer project, we propose the recently developed base (BE) and prime editing (PE) (8, 9) as tailored tools to correct the most common RTT-causing mutations. These approaches can ensure higher efficacy with a single intervention than standard Cas9 nuclease approaches, with negligible indel generation and off-target effects(10). These editors can be delivered by viral (11) or, preferably, non-viral gene delivery systems (12, 13). Their therapeutic potential has been demonstrated in many cell types and organisms(14, 15). In mice, these strategies also provided their efficiency in the installation of desired editing in the central nervous systems(16, 17), the primary site of MECP2 expression and manifestation of RTT disease. We aim at providing evidence that the BE and PE can revert 4 out the 8 most frequent MECP2 pathogenic variants (p.R168*, p.R255*, p.R270*, p.R294*). To this purpose, we have created expression plasmids for MECP2-GFP fusion variants, editors (both BE and PE), and developed engineered MECP2 cellular models (stable and knock-in cell lines). We are currently in the screening phase aimed at identifying the best combination (editor with peg/gRNAs) able to target and correct the selected MECP2 variants. The evaluation of correction efficiency as well as specificity in ex-vivo cellular models, represented by patients' fibroblast cell lines available at the Telethon Network of Genetic Biobanks, will represent the next step in this one-year project. If successful, the results will help attracting national and international funds and industrial partners to develop and optimize these new therapeutic options for RTT and pave the way for translations to other inherited human diseases, also of neurological onset. Overall, this project will provide the proof-of-concept that BE and PE can ensure effective and stable rescue of the natural MECP2 expression with a single intervention and may result in a life-long cure for people with RTT.

Base e Prime editing del DNA come nuovo trattamento personalizzato per la sindrome di Rett La sindrome di Rett (RTT) (OMIM #312750) è un grave disturbo dello sviluppo neurologico comunemente causato da mutazioni localizzate nel gene MECP2, che codifica per la proteina analoga MECP2 (1). Tra tutte le mutazioni, 8 cambiamenti a singolo nucleotide rappresentano circa il 70% di tutte le variazioni identificate(2). È importante notare che, mentre la perdita della funzione di MeCP2 causa la RTT, la duplicazione del locus causa anche un grave disturbo dello sviluppo neurologico, la sindrome da duplicazione di MECP2 (MDS)(3), suggerendo che MECP2 è un gene sensibile al dosaggio, in cui sia la perdita che l'aumento di funzione causano la malattia(4). Nonostante i primi studi clinici abbiano mostrato risultati promettenti, attualmente non sono disponibili farmaci per la malattia(5). D'altro canto, sono stati sviluppati approcci innovativi basati sulla terapia genica e sull'editing del genoma o dell'RNA, che hanno fornito risultati promettenti(6, 7). Tuttavia, diversi problemi ne hanno impedito l'ulteriore sviluppo terapeutico. In questo progetto proponiamo i metodi di base (BE) e prime (PE) editing, recentemente sviluppati (8, 9), come strumenti su misura per correggere le mutazioni più comuni che causano RTT. Questi approcci, rispetto agli approcci standard basati sulla nucleasi Cas9, possono garantire un'efficacia maggiore con un singolo intervento, e sono associati ad effetti indesiderati trascurabili(10). Questi editor possono essere veicolati da sistemi virali (11) o, preferibilmente, non virali (12, 13). Il loro potenziale terapeutico è stato dimostrato in molti tipi di cellule e organismi (14, 15). Nei topi, queste strategie hanno dimostrato la loro efficacia anche nel sistema nervoso centrale(16, 17), il sito primario di espressione di MECP2 e di manifestazione della malattia RTT. Il nostro obiettivo è fornire la prova che BE e la PE possono correggere 4 delle 8 varianti patogene più frequenti di MECP2 (p.R168*, p.R255*, p.R270*, p.R294*). A questo scopo, abbiamo creato plasmidi di espressione per le varianti di fusione MECP2-GFP, per gli editors (sia BE che PE) e sviluppato modelli cellulari MECP2 ingegnerizzati (linee cellulari stabili e knock-in). Attualmente siamo in fase di screening per identificare la migliore combinazione (editor con suo RNA) in grado di colpire e correggere le varianti MECP2 selezionate. Il passo successivo sarà quello di valutare l'efficacia e la specificità in linee cellulari derivanti dai pazienti stessi disponibili presso le Biobanche Genetiche di Telethon. In caso di successo, i risultati contribuiranno ad attrarre fondi nazionali e internazionali e partner industriali per sviluppare e ottimizzare queste nuove opzioni terapeutiche per la RTT.

1. J. L. Neul et al., Ann Neurol. 68, 944-950 (2010). 2. F. F. Operto et al., Brain Behav. 9, e01250 (2019). 3. D. del Gaudio et al., Genet Med. 8, 784-792 (2006). 4. H.-T. Chao, H. Y. Zoghbi, Nat Neurosci. 15, 176-177 (2012). 5. D. G. Glaze et al., Neurology. 92, e1912-e1925 (2019). 6. S. Croci et al., Eur J Hum Genet. 28, 1231-1242 (2020). 7. K. K. E. Gadalla et al., Mol Ther. 21, 18-30 (2013). 8. A. C. Komor, et al., Nature. 533, 420-424 (2016). 9. A. V. Anzalone et al., Nature. 576, 149-157 (2019). 10. O. Habib et al., Nucleic Acids Research. 50, 1187-1197 (2022). 11. T. Rothgangl et al., Nat Biotechnol. 39, 949-957 (2021). 12. L. Villiger et al., Nat Biomed Eng. 5, 179-189 (2021). 13. K. Musunuru et al., Nature. 593, 429-434 (2021). 14. P. Liu et al., Nat Commun. 12, 2121-2121 (2021). 15. D. Böck et al., Sci Transl Med. 14, eabl9238 (2022). 16. C. K. W. Lim et al., Mol Ther. 28, 1177-1189 (2020). 17. J. M. Levy et al., Nature Biomedical Engineering. 4, 97-110 (2020).

Rett Syndrome

Sindrome di Rett