Inherited disorders of hemoglobin such as Beta-thalassemia (Beta-thal) and Sickle Cell Disease (SCD) affect the health of countless people worldwide (1). There is no generally available definitive treatment except for bone marrow transplantation with many limitations. Alternative therapies are under investigation but remain largely experimental and long-term effects must be estimated (2-4). Our project objective is to evaluate a possible therapeutic approach based on the enhancement of HbA2 (alpha2delta2). Although expressed at a low level, HbA2 is fully functional (5). HbA2 has been validated as a therapeutic target for Beta-thal and SCD by our lab (6,7). In a recent GWAS study CCND3 was found associated with HbA2 levels (8). The CCND3 gene encodes for the D3 cyclin, one member of the mammalian cell cycle machinery. Ccnd3 knockout mice are viable and fertile. In human and mouse D3 cyclin controls erythrocyte size and number (9). We have produced preliminary results showing that CCND3 deprivation produces a robust increase of delta-globin expression in a transgenic mouse model. This observation prompted us to study whether modulation of CCND3 expression would be able to increase HbA2 level as a therapy for Beta-thal and SCD. To explore this, we are evaluating if the D3 cyclin gene deprivation, in vivo, would produce an increase of HbA2 sufficient to improve Beta-thal in a humanized mouse model. We have utilized a humanized transgenic mice carry a common human beta zero-thalassemia mutation (ANUN mice) (10). Breeding ANUN mice to heterozygous beta-globin knockout (th3+) mice allows the generation of ANUN/th3+ mice. This mouse has been characterized in our lab and shows a phenotype of Beta-thal intermedia as expected. We are currently evaluating if D3 cyclin gene deprivation, in this model, produces an increase of HbA2 sufficient to improve the pathology. At the same time, to evaluate if the D3 cyclin gene deprivation would increase HbA2 and HbF in human erythroid cells we have designed a genome-editing approach using the CRISPR/Cas9 technology in HUDEP-2 cells (11). Experiments and validation of the editing is in progress. We are also evaluating the effect of cell cycle modulation, obtained by pharmacological treatment, in increasing delta-globin gene expression in primary murine erythroid cell derived from a transgenic mice line containing a single copy human Beta-globin cluster (12). This secondary screening has been necessary to validate the effect of cell cycle modulators previously identified by small molecules screening on a reporter transgenic cell line (Telethon GGP14065). At the moment the biological activity of one molecule (C18) has been confirmed. The efficacy of this compound will shortly be evaluated in vivo on ANUN/th3+ mice. We are confident that the results of our project could contribute to the development of new therapeutic strategies and to the validation of a new target for the treatment of Beta-hemoglobinopathies.

IL GENE DELTA-GLOBINICO UMANO QUALE TARGET TERAPEUTICO PER LE BETA-EMOGLOBINOPATIE. VALIDAZIONE DI UN TARGET POST GWAS E VALUTAZIONE DI MOLECOLE IN MODELLI PRE-CLINICI. La Beta-Talassemia e L'Anemia Falciforme (Beta-emoglobinopatie) sono le malattie monogeniche più frequenti al mondo e colpiscono la salute di milioni di persone. Il trapianto di midollo osseo è l'unico trattamento definitivo disponibile per queste malattie. Tuttavia, questa terapia ha dei limiti e non è accessibile alla maggior parte dei pazienti. La ricerca di terapie alternative definitive si è concentrata principalmente su approcci che utilizzano tecniche d'ingegneria genetica che sono ancora largamente sperimentali e necessitano di lunghi tempi di osservazione per valutarne l'efficacia e la sicurezza. Queste malattie, inoltre, sono diffuse soprattutto nelle aree del mondo in cui il sistema sanitario è ancora lontano dal raggiungere gli standard necessari per eseguire queste procedure. In queste aree, per quanto riguarda l'Anemia Falciforme, per esempio, ancora oggi ogni anno nascono circa 300.000 bambini affetti e 500 bambini muoiono ogni giorno per mancanza di diagnosi e terapia precoce. Sono quindi necessarie e urgenti ulteriori opzioni di terapie curative. L'obiettivo di questo progetto è di valutare un possibile approccio al trattamento delle Beta-emoglobinopatie basato sull'aumento dell'espressione dell'emoglobina-A2 (HbA2). L'HbA2 è normalmente espressa nell'adulto a basi livelli, ma è pienamente funzionale. Recentemente è stato scoperto che un gene (CCND3) che regola le divisioni dei globuli rossi è legato ai livelli di HbA2. La proteina prodotta da questo gene può essere modulata da molecole. Proponiamo di valutare se è possibile, attraverso la modulazione del CCND3, e di altre proteine legate al ciclo cellulare, aumentare la concentrazione di HbA2 a livelli terapeutici in modelli sperimentali di malattia. I risultati di questo progetto potrebbero portare allo sviluppo di nuovi approcci terapeutici per le Beta-emoglobinopatie.

References 1) Weatherall DJ. Blood. 2010; Jun 3;115(22):4331-6. 2) Crossley M, et al. Trends Genet. 2022 Dec;38(12):1284-1298. doi: 10.1016/j.tig.2022.07.003. 3) Leonard A et al. Hematol Oncol Clin North Am. 2022 Aug;36(4):769-795. 4) Rahimmanesh et al. . 2022 Jun 4;11(6):862. 5) Steinberg MH, Rodgers GP. 2015 Br J Haematol. Sep;170(6):781-7. 6) Manchinu MF, , et al. 2014 Haematologica. Jan;99(1):76-84. 7) Porcu S et al. 2021 Br J Haematol. Jun;193(6):1228-1237. 8) Danjou F, , 2015 Nat Genet. Nov;47(11):1264-71. 9) Sankaran VG et al. 2012 Genes Dev. Sep 15;26(18):2075-87. 10)Jamsai D et al. 2005. Genomics. Apr;85(4):453-61. 11) Kurita R,et al. 2013 PLoS One. ;8(3):e59890. 12) Strouboulis J et al. 1992 Genes Dev. 1992; Oct;6(10):1857-64.

Beta-thalassemia, Sickle Cell Disease

Beta talassemia, Anemia Falciforme