Haemophilia A (HA) is a rare bleeding disorder caused by factor 8 (F8) mutations. The reduction or lack of plasma FVIII causes prolonged bleedings episodes, either spontaneously or secondary to trauma, with clinical severity proportional to the degree of FVIII reduction1. To date, there is no definitive cure for HA, with the current therapeutic practice being a replacement therapy of plasma-derived or recombinant human FVIII (rhFVIII) delivered on demand or as prophylaxis to prevent bleeding events2. Despite the amelioration with replacement therapy, 20 to 40% of patients with the severe form of HA develop inhibitors making the treatment ineffective3-4. Clinical manifestations are spontaneous bleedings consisting primarily of hemarthrosis and intracranial haemorrhages (ICH). The ICHs represent the most serious event that can occur in HA patients resulting in 20% rates of mortality and disability5-7. The manifestation of ICH is often spontaneous, and it mainly occurs in patients that do not adhere to the prophylaxis regimen resulting in inadequate levels of blood FVIII8-9. To date, the correlation between FVIII and the impairment of vessel stability in HA patients is poorly understood. Interestingly, we and others have demonstrated that endothelial cells (ECs) are the main FVIII producers10-12, however, an association between endothelial fragility and the absence of or low activity of FVIII has never been explored. Moreover, very little is known regarding the differences in the genetic profile between healthy and HA ECs that can be isolated from the peripheral blood, as blood outgrowth endothelial cells (BOECs)13, or differentiated from induced pluripotent stem cells (iPSCs)14. Both EC models, once transduced with a lentiviral vector (LV) carrying the coagulation FVIII (LV-FVIII) and implanted into a prevascularized medical device were able to correct the bleeding phenotype of HA mice13-14. Therefore, based on the clinical observation of a general endothelial fragility in HA patients, we investigated the role of FVIII in the maintenance of EC stability by evaluating the differences in the functionality and the transcriptomic profile of healthy, HA, and LV-FVIII-transduced HA ECs using two EC models. We show that FVIII plays a role in EC functionality. ECs knockout generated by CRISPR/Cas9 and HA ECs showed alteration of vessel-formation, migration and vessel permeability. Importantly, the treatment with rhFVIII or by LV-FVIII rescued the impaired EC phenotype. The endothelial function of FVIII was confirmed in a mouse model of HA where the altered angiogenesis, extracellular matrix integrity and vessel permeability were rescued by ectopic FVIII. Transcriptomic profiles revealed that FVIII regulates the expression of endothelial basement membrane and extracellular matrix genes. Thus, lack of FVIII in HA patients impairs not only coagulation but also endothelial transcriptome predisposing patients to increased risk of trauma due to vessel fragility.
Il ruolo del FVIII nella funzionalità delle cellule endoteliali
L'emofilia A è una malattia rara causata dall'assenza del fattore VIII (FVIII), una proteina essenziale per la coagulazione. Non essendoci una cura definitiva per questa malattia, attualmente i pazienti ricevono una terapia con plasma derivati o FVIII ricombinante. L'assenza o la riduzione del FVIII nel sangue aumenta la possibilità di avere sanguinamenti in diverse parti del corpo che possono causare emorragie a livello articolare e/o intracraniche. Queste emorragie a livello del cervello avvengono con maggior frequenza nei bambini e nei pazienti che non aderiscono perfettamente alla profilassi.
Il nostro gruppo di ricerca e altri gruppi di ricerca hanno dimostrato che il FVIII è maggiormente prodotto dalle cellule endoteliali dei vasi sanguigni. Tuttavia, si hanno ancora troppo poche informazioni circa la corretta funzionalità dei vasi nei pazienti emofilici. Abbiamo quindi deciso di valutare la permeabilità dei vasi sanguigni in topi emofilici rispetto a quelli sani riscontrando che i topi malati avevano vasi più permeabili. Per indagare ulteriormente l'effetto del FVIII in modelli cellulari endoteliali, abbiamo isolato con un solo prelievo di sangue un tipo di cellule endoteliali da volontari sani e pazienti emofilici. Innanzitutto, abbiamo osservato una diversa funzionalità tra le cellule dei sani e quelle derivate da pazienti affetti da emofilia A. Infatti, le cellule endoteliali emofiliche non sono in grado di formare vasi stabili e organizzati come accade nei sani le cui cellule endoteliali formano vasi ben strutturati. Dopodiché, abbiamo modificato il DNA delle cellule sane ottenendo cellule che non esprimevano FVIII, simili a quelle emofiliche. Inoltre, anche le cellule emofiliche sono state modificate introducendo la forma corretta del gene del F8 generando così un modello simile a quello sano. Gli esperimenti su queste cellule modificate hanno ulteriormente dimostrato il ruolo centrale del FVIII nella stabilizzazione dei vasi: l'inserimento del FVIII in cellule emofiliche ha incrementato la loro funzionalità, mentre l'introduzione di mutazioni nel gene del F8 delle cellule sane ha fatto perdere la loro capacità di formare vasi stabili e funzionali.
Questi esperimenti dimostrano che la mancanza di FVIII nelle cellule endoteliali dei vasi non causa solo problemi a livello della coagulazione ma aumenta anche la fragilità dei vasi stessi.
1 Bolton-Maggs & Pasi, 2003
2 Collins et al, 2009
3 Aledort et al, 2019
4 Van Den Berg et al, 2019
5 Ljung, 2008
6 Zanon et al, 2012;
7 Senapati et al, 2016
8 Zwagemaker et al, 2021
9 Kulkarni et al, 2017
10 Follenzi et al, 2008
11 Fomin et al, 2013
12 Zanolini et al, 2015
13 Olgasi et al, 2021
14 Olgasi et al, 2018