Introduction: In humans, the mitochondrial DNA (mtDNA) is replicated by the DNA polymerase gamma (POLG) and its accessory unit POLG2, both encoded by nuclear genes. Mutations in these loci cause at least six mitochondrial diseases with Mendelian inheritance, collectively named POLG-related disorders, characterized by multi-organ dysfunction, mtDNA depletion and/or accumulation of multiple deletions. The therapeutic treatment of POLG diseases is currently limited to symptom management. Aim and Strategy: To identify new drugs with therapeutic effects on POLG disorders, we have adopted a multi-species approach, based on drug pre-screen in Polg-mutated yeast (mip1), followed by drug validation in zebrafish Polg and Polg2 mutants, specifically generated and characterized during this project. Results: The screen of drugs in yeast has been performed by evaluating the rescue of respiratory growth due to mtDNA instability ("petite" phenotype) in a thermosensitive mip1 mutant. More in-depth analysis included quantitative evaluation of respiratory activity, mtDNA levels, Mip1 expression, mitophagy and dNTPs levels. The screen succeeded in identifying approximately 20 drugs able to rescue at least two of these phenotypes: three drugs are promising, being able to increase the mtDNA levels, the Mip1 expression and the respiratory activity. After proving that one of the molecules found in a previous screening, Clofilium tosylate (CLO), could rescue POLG phenotypes in multiple systems, including yeast, worm, human fibroblasts and zebrafish Polg mutants, we tested the molecule in a zebrafish Polg2 KO line. Interestingly, the treatment with CLO could rescue mtDNA levels and motor performances in Polg2 mutant animals, demonstrating that CLO is effective also under accessory subunit (Polg2) deficiency. This result suggests a wider range of CLO applicability within the spectrum of genetically heterogeneous POLG disorders. Other candidate drugs are now under analysis. Preliminary results indicate that another promising molecule is "MRS2", shown to rescue mtDNA levels in zebrafish Polg2 mutants. Further tests are required to prove its efficacy under both Polg and Polg2 deficiency, as well as its synergic activity in combination with CLO and other positive hits arising from the drug screen.

Titolo: Identificazione di farmaci bersaglianti le malattie POLG attraverso uno screening basato su lievito e zebrafish Introduzione: Negli esseri umani esiste un organello che funge da centrale energetica per le cellule: il mitocondrio. Questo organello è dotato di un proprio patrimonio genetico: il DNA mitocondriale (mtDNA). Tale "mtDNA" viene prodotto e mantenuto integro dalla "DNA polimerasi mitocondriale", un macchinario proteico costituito dalle componenti "POLG" e "POLG2". Se i geni per queste proteine mutano, si hanno delle malattie "mitocondriali" ereditarie, dette "POLG", che colpiscono svariati organi nei pazienti. La terapia per le malattie POLG è al momento basata solo sulla gestione dei sintomi. Scopo e strategia del progetto: per identificare nuovi farmaci efficaci nelle malattie POLG, abbiamo adottato una strategia "multi-specie", basata sul test di farmaci nel lievito "mip1", un fungo unicellulare mutante, che riproduce la malattia umana POLG su scala cellulare. I farmaci più promettenti vengono poi confermati in un modello animale semplificato, lo zebrafish o pesce zebra. Nel corso del progetto, infatti, sono stati prodotti degli zebrafish mutanti, di tipo "Polg" e Polg2", che riproducono in miniatura la malattia umana POLG. L'embrione di zebrafish è infatti millimetrico, mentre l'adulto misura circa 5 centimetri. Il saggio di farmaci è quindi enormemente facilitato da modelli di studio di così piccole dimensioni. Risultati: il saggio di farmaci nel lievito ha permesso di identificare con successo circa 20 molecole candidate nella cura delle malattie POLG. Di queste, la molecola più promettente (CLO) è stata saggiata anche su un animale invertebrato (il verme "C. elegans"), su fibroblasti di pazienti POLG e su zebrafish Polg. In tutti i casi la molecola ha ripristinato una normale quantità di DNA mitocondriale, correggendo alcuni aspetti della malattia. Degno di nota, abbiamo verificato che CLO funziona anche negli zebrafish di tipo Polg2, correggendo sia la quantità di mtDNA che le funzioni motorie. Pertanto, CLO si dimostra un farmaco potenzialmente applicabile a diverse classi di pazienti (sia POLG che POLG2). Le analisi sulle altre molecole candidate sono tuttora in corso. I risultati preliminari indicano che un'ulteriore molecola, "MRS2", è in grado di correggere la quantità di mtDNA negli zebrafish di tipo "Polg2". Si tratta ora di verificare la sua efficacia anche negli zebrafish di tipo Polg, oltre che l'eventuale effetto in combinazione con il farmaco CLO e con le altre molecole candidate, identificate nel corso di questo progetto.

Rahman S, Copeland WC. POLG-related disorders and their neurological manifestations. Nat Rev Neurol. 2019 Jan;15(1):40-52. doi: 10.1038/s41582-018-0101-0. Pitayu L, Baruffini E, Rodier C, Rötig A, Lodi T, Delahodde A. Combined use of Saccharomyces cerevisiae, Caenorhabditis elegans and patient fibroblasts leads to the identification of clofilium tosylate as a potential therapeutic chemical against POLG-related diseases. Hum Mol Genet. 2016 Feb 15;25(4):715-27. doi: 10.1093/hmg/ddv509. Epub 2015 Dec 21. Facchinello N, Laquatra C, Locatello L, Beffagna G, Brañas Casas R, Fornetto C, Dinarello A, Martorano L, Vettori A, Risato G, Celeghin R, Meneghetti G, Santoro MM, Delahodde A, Vanzi F, Rasola A, Dalla Valle L, Rasotto MB, Lodi T, Baruffini E, Argenton F, Tiso N. Efficient clofilium tosylate-mediated rescue of POLG-related disease phenotypes in zebrafish. Cell Death Dis. 2021 Jan 19;12(1):100. doi: 10.1038/s41419-020-03359-z.

POLG mitochondrial disorders

Malattie mitocondriali POLG