Globoid cell leukodystrophy (GLD) is a lysosomal storage disorder (LSD) caused by the deficiency of the β-galactosylceramidase (GALC) enzyme, which leads to the accumulation of toxic substrates in myelinating cells and consequent severe dysfunction of the central and peripheral nervous system. Experimental and clinical evidence suggests that the therapeutic benefit of ex vivo lentiviral vector (LV) hematopoietic stem cell (HSC) gene therapy (GT) in neurodegenerative LSDs relies on supraphysiological enzyme production by transduced cells and widespread enzyme distribution in affected tissues. In GLD, the limited GALC overexpression achieved in HSCs ultimately results in insufficient enzyme production and secretion by transplanted cells, overall diminishing enzyme bioavailability. Chimeric lysosomal enzymes with increased bioavailability may benefit GLD, reducing the requirement for a high level of GALC overexpression and improving the safety of the approach. We report the generation and in vitro validation of LVs encoding for murine GALC enzymes engineered to express alternative signal peptides to increase secretion and peptide domains to enhance blood-brain barrier (BBB) crossing. We show an advantage of chimeric GALC enzymes over the unmodified counterpart in terms of supraphysiological expression and secretion by GLD murine neural stem/progenitor cells (NSCs), HSCs, and progeny. Importantly, the secreted chimeric enzymes are recaptured and delivered to the lysosomes of GALC-deficient neural cells, which become metabolically cross-corrected. Of note, LVs encoding for chimeric human GALC enzymes safely and efficiently transduce human CD34+ HSCs. Preliminary results suggest increased secretion of the chimeric human GALC enzymes with respect to the unmodified counterpart and cross-correction of GLD human induced pluripotent stem cell-derived neurons/glial cells. The evaluation of the safety and therapeutic potential of these chimeric LVs in the GLD murine model in the context of HSC GT will pave the way to the clinical development of LV-based GT for this untreatable disorder.
Validazione in vitro di vettori lentivirali codificanti per enzimi GALC chimerici umani e murini per migliorare l'efficacia degli approcci di terapia genica per la leucodistrofia a cellule globoidi
La leucodistrofia a cellule globoidi (GLD) è una malattia da accumulo lisosomiale causata dalla carenza dell'enzima β-galattosilceramidasi (GALC), che comporta l'accumulo di substrati tossici nelle cellule mielinizzanti e conseguente grave disfunzione del sistema nervoso centrale e periferico. Il beneficio terapeutico della terapia genica (GT) con cellule staminali ematopoietiche (HSC) trasdotte ex vivo con vettori lentivirali (LV) in LSD neurodegenerative è legato all'overespressione dell'enzima prodotto dalle cellule trasdotte e dalla distribuzione della proteina nei tessuti affetti. Nella GLD, la produzione di enzima da parte delle HSC trasdotte è modesta e risulta in una limitata biodisponibilità. Per questa ragione, enzimi GALC chimerici con un'aumentata biodisponibilità possono dare un vantaggio nel contesto della GLD, riducendo la necessità di un alto livello di overespressione dell'enzima e migliorando la sicurezza dell'approccio di GT. Abbiamo generato e validato in vitro LV che codificano per gli enzimi murini GALC ingegnerizzati per esprimere: I) peptide segnale alternativo, per aumentare la secrezione; II) domini peptidici, per incrementare l'attraversamento della barriera emato-encefalica (BBB). Abbiamo mostrato il vantaggio degli enzimi chimerici rispetto alla controparte non modificata in termini di overespressione e di secrezione dalle cellule staminali neurali (NSC) e HSC derivate dal modello animale GLD. Gli enzimi chimerici secreti vengono captati e portati al lisosoma delle cellule neurali GLD, determinando la cross correzione metabolica di queste cellule. Inoltre, LV che codificano per l'enzima GALC chimerico umano trasduscono in modo sicuro ed efficiente le HSC umane. Risultati preliminari suggeriscono una maggiore secrezione degli enzimi chimerici rispetto alla controparte non modificata e la cross correzione delle cellule neuronali/gliali differenziate da cellule staminali pluripotenti umane derivate da pazienti GLD. La valutazione della sicurezza e del potenziale terapeutico di questi LV chimerici nel modello murino GLD nel contesto di HSC GT saranno cruciali in prospettiva del suo sviluppo clinico.
Globoid Cell Leukodystrophy