In vitro cultured neuronal networks are a valuable experimental model to unravel many aspects of brain physiology. However, it is unclear to which extent cultured neurons can reliably model genetic diseases. Indeed the establishment of an in vitro model based on cultured neurons presents some limitations which need to be taken into consideration. On the one hand, 2D-cultures cannot represent the full complexity of the brain. Another concern regards the experimental variability among different preparations of neuronal cultures. Taking these limitations into consideration, in this work, we tested the usefulness of cortical neuronal cultures obtained from genetically modified knockin-mice (KI) mimicking a human monogenetic migraine model. The KI mice recapitulate familial hemiplegic migraine of type 3 (FHM3), a genetic form of migraine with aura caused by gain-of-function mutations in the SCN1A gene encoding the Nav1.1 channel [1]. In particular, we employed two KI mouse models of FHM3 bearing each one a mutation in the Scn1a gene encoding the Nav1.1 channel; for one of these mouse models, neurophysiological phenomena have been recently investigated [2], disclosing key differences between the heterozygous and the wild-type phenotype. In the present work, brain cortices were dissected from WT and FHM3-KI embryos at E17 and dissociated neurons were cultured in defined medium for up to 25 days. Cultures were then studied by whole-cell and outside-out patch clamp recording while population excitability was monitored using microelectrode arrays (MEAs). By patch-clamp recording, kinetic parameters of Na current activation and inactivation were determined for single neurons, while using MEA devices electrical activity of the whole cortical network was investigated. In particular, the effect of the Na current blocker GS967 on the spontaneous electrical activity of the network was investigated for the different genotypes (WT, heterozygous KI, homozygous KI). In addition, the expression level of brain Nav channel genes, namely Scn1a, 2a, 3a, and 8a was estimated by RT-qPCR to detect possible dysregulation caused by FHM3 disease. Overall, the results suggest that the in vitro model can recapitulate several features observed in the FHM3 mouse models and it is worth emphasizing that, despite its limitation, the use of dissociated cultures may be a valid alternative method to reduce the number of animals used in experimental studies.

Utilizzo di colture neuronali in vitro per la valutazione di trattamenti farmacologici per una forma genetica di emicrania emiplegica. Le colture di neuroni corticali costituiscono un valido modello sperimentale per lo studio di molti aspetti della fisiologia del cervello. Non è chiaro tuttavia quanto queste possano effettivamente essere utilizzate per lo studio di malattie genetiche del sistema nervoso in quanto senz'altro presentano limiti che vanno tenuti in considerazione. Infatti da un lato la bidimensionalità della coltura non può riprodurre interamente la complessità del cervello, dall'altro la variabilità tra una preparazione e l'altra può interferire con la riproducibilità dei risultati. Consapevoli di questi limiti, in questo studio abbiamo verificato le potenzialità di colture neuronali corticali ottenute da due modelli di topo geneticamente modificati mediante l'inserimento nel loro genoma di due diverse mutazioni che provocano nell'uomo l'Emicrania Emiplegica familiare di tipo 3 (FHM3). FHM3 è una forma genetica di emicrania con aura causata da una mutazione del gene SCNA1 che codifica Nav1.1, un canale ionico presente nei neuroni [1]. Per uno dei due modelli di topo utilizzati nella nostra ricerca, grazie allo studio finanziato da Telethon, sono già stati approfonditi i principali aspetti neurofisiologici [2] correlati con la malattia FHM3. Nel lavoro che qui presentiamo abbiamo utilizzato come modello di studio le colture neuronali provenienti da cortecce di embrioni E17. Le cortecce sono stati dissociate in singoli neuroni i quali sono stati poi messi in coltura e mantenuti in un terreno specifico per 25 giorni. L'attività elettrica delle colture in maturazione è stata testata a livello di singola cellula mediante patch-clamp o a livello di rete neuronale utilizzando un sistema di registrazione multielettrodo (microelectrode array, MEA). Infine con l'obiettivo di esplorare potenziali approcci terapeutici per FHM3, il composto GS967, bloccante della corrente tardiva del Na, è stato somministrato alle colture provenienti dai tre genotipi dei topi modello di FHM3 (WT, mutante eterozigote, mutante omozigote) ed è stata valutato il suo effetto sull'attività delle reti neuronali formatesi. Complessivamente i risultati della nostra ricerca indicano che le colture in vitro mantengono senz'altro alcune importanti proprietà neurofisiologiche osservate nei ceppi di topo modello di FHM3 e possono quindi a loro volta costituire un buon modello della malattia FHM3. Inoltre, nonostante i limiti sopra elencati, l'uso di colture dissociate può costituire anche un metodo alternativo finalizzato a ridurre il numero degli animali utilizzati negli studi sperimentali.

[1] Barbieri et al. J Headache Pain 2019 doi: 10.1186/s10194-019-1056-2. [2] Auffenberg et al. Journal Clinical Investigation 2021 doi :10.1172/JCI142202

Familial Hemiplegic Migraine type 3

Emicrania Emiplegica familiare tipo 3