Mucopolysaccharidosis type IVA (MPSIVA) is a lysosomal storage disease caused by mutations in the GALNS gene with consequent deficiency of N-acetylgalactosamine-6-sulphate sulphatase (GALNS) enzyme. As a result, progressive accumulation of Keratan Sulphate (KS) and Chondroitin-6-Sulphate (C6S) is observed in tissues, clinically translating in severe skeletal phenotypes and growth delay Vimizin, an enzyme-replacement therapy, is the only registered treatment against MPSIVA, though not curative. An ex-vivo gene therapy (GT) approach could offer a definitive therapeutic option for MPSIVA patients; however, available murine models are not representative of the human disease, making therapy development challenging. Thus, we propose to establish and characterise a new MPSIVA mouse model. In C57Bl/6J mice, we generated a mutation in the GALNS locus by CRISPR-Cas9, obtaining five different variants. Galns-/- (knockouts, KOs) for each mutation are being evaluated using biochemical (enzymatic activity, KS accumulation), morphological (length measurement, weight gain, CT-scan), behavioural (rotarod, grip and footprint tests) and histopathological parameters to select the most representative model. Additionally, we have investigated the models' systemic and organ-associated inflammation. Biochemical analyses have confirmed all KOs to have no GALNS activity, whilst KS accumulation has been detected in the peripheral blood of two of our KO variants. However, only one out of four maintained lower weight gain over time and shorter long bones, suggesting a skeletal involvement. In line with these results, the same KO variant showed differences in bone resistance and cortical composition and performed worst in the behavioural tests. Overall, these results will lead to select the most representative MPSIVA mouse model for further of a novel lentiviral-based ex-vivo GT, while highlighting cellular and molecular mechanisms behind MPSIVA progression.

Sviluppo e descrizione di un nuovo modello di topo per la Mucopolisaccaridosi di tipo IVA La Mucopolisaccaridosi di tipo IVA (MPSIVA) è una malattia genetica rara, causata dalla mutazione del gene GALNS. Tale mutazione causa l'assenza della proteina N-acetilgalattosamina-6-solfatasi (GALNS), un enzima responsabile della degradazione delle molecole di glicosamminoglicani. Senza essere degradate, queste molecole si accumulano all'interno di compartimenti cellulari, i lisosomi, provocando gravi sintomi scheletrici nei pazienti, a partire da 1 anno di età. Ad oggi, l'unica terapia disponibile per MPSIVA è un enzima sostitutivo, che tuttavia non corregge la malattia, ma ne attenua solo i sintomi, rendendo necessario lo sviluppo di una terapia innovativa. Alla luce di risultati ottenuti precedentemente presso il nostro istituto, la terapia genica offrirebbe una nuova opzione di trattamento per questi pazienti; tuttavia, non esiste ancora nessun modello di topo sul quale poter testare sicurezza ed efficacia di questa terapia. Pertanto, con questo progetto proponiamo di sviluppare e descrivere un nuovo modello di topo per MPSIVA. Tramite gene editing (alterazione diretta di un gene), abbiamo creato 4 varianti della mutazione di nostro interesse, sul gene codificante per la proteina GALNS. Su questi modelli abbiamo proceduto ad effettuare test biochimici, morfologici, immuno-istologici e comportamentali per definire quale tra le 4 varianti producesse il topo più rappresentativo dei sintomi osservati nei pazienti MPSIVA. Al momento, nessun topo omozigote per la mutazione mostra attività dell'enzima GALNS e tutti presentano un variabile livello di accumulo di Cheratano Solfato nel sangue. Tuttavia, monitorando il peso e le dimensioni macroscopiche nei topi delle 4 varianti, abbiamo osservato come solo uno di questi gruppi si mantenga più piccolo e presenti tibie e femori più corti rispetto a tutti gli altri gruppi. Lo stesso gruppo, inoltre, presenta alterazioni nella composizione delle ossa e nel livello di forza degli arti anteriori, misurato tramite Grip Test. Completando queste analisi sarà possibile selezionare il modello più rappresentativo per MPSIVA ed usarlo per lo sviluppo di una terapia genica innovativa, ampliando e migliorando opzioni terapeutiche per questa malattia.

Mucopolysaccharidosis type IVA (Morquio Disease)

Mucopolisaccaridosi tipo IVA (Sindrome di Morquio)