SCIE.16.113 - AUTOSOMAL DOMINANT OSTEOPETROSIS TYPE 2 (ADO2): CLOSE TO THE CURE. WHAT TO WE MISS?

TOPIC:
Genetic bone disease
AUTORI:
Patrizii P. (L'Aquila) , Maurizi A. (L'Aquila) , Ewe A. (Leipzig) , Aigner A. (Leipzig) , Teti A.M. (L'Aquila)
Abstract:
Autosomal Dominant Osteopetrosis type 2 (ADO2) is a genetic bone disease with high morbidity, due to impairment of osteoclast function, characterized by fragile bones prone to multiple fractures. ADO2 has no cure and patients are treated only palliatively. In this project, we advanced an innovative siRNA therapy that we previously proved to be specific and effective in ADO2 mice. It is based on RNAi-mediated gene knockdown, targeting the heterozygous diseased mRNA encoded by the ADO2 mutant gene, CLCN7, without affecting the normal mRNA. We focused on the Clcn7G213R siRNA (CLCN7G215R siRNA in humans) and tested formulations that could safely and efficiently mediate systemic delivery. To this end, the Clcn7G213R siRNA was complexed with non-viral nanoparticles and two formulations, labelled A and B, were tested in vivo in ADO2 mice. Formulation A was effective but highly toxic at the dose of 4mg/Kg siRNA, administered intraperitoneally 3 days/week for 4 weeks. A lower dose of 2mg/Kg siRNA reduced the mutant Clcn7G213R mRNA expression by 50% in femurs, with a reduction of bone volume over total tissue volume, and improvement of osteoclast number/surface and erosion surface over bone surface in proximal tibia, suggesting improvement of bone resorption. However, this dose did not enhance the bone quality in femurs, which remained fragile. Moreover, the mutant Clcn7G213R mRNA expression was downregulated in lung but not in peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) or in other visceral organs affected by ADO2, limiting its translational application to improve the extra-skeletal phenotype. By contrast, 4 mg/Kg siRNA in formulation B was well tolerated and most effective in downregulating the mutant Clcn7G213R mRNA expression in bone. It was able to return the bone structural variables, the osteoclast variables and bone resorption to the wild-type level. Furthermore, bone quality recovered and the expression of the mutant Clcn7G213R mRNA was downregulated in PBMCs and in all visceral organs assessed, except for the brain, possibly due to the presence of the blood-brain barrier. Formulation B was then selected for toxicity studies in wild-type mice, which were treated with the maximal siRNA concentration allowed by the nanoparticle formulation (8 mg/Kg siRNA), administered intraperitoneally 5 days/week for two weeks. Results demonstrated no deaths or adverse events. Treatment was well tolerated, with no topical reactions at the site of injection and no impairment of walking ability or alterations in behaviour and food intake. Consistently, weight gain was normal over the two weeks of treatment and, at sacrifice, the weights of visceral organs, including brains, lungs, hearts, kidneys, livers, and spleens, showed no changes compared to control mice treated with saline. In conclusion, our results indicate that the Clcn7G213R siRNA nanoparticle formulation B provides a promising avenue for future development of a RNAi-based therapy for ADO2 patients.
Abstract per il pubblico laico:
L'osteopetrosi autosomica dominante di tipo 2 (ADO2) è una malattia genetica ossea causata della compromissione della funzione di cellule denominate osteoclasti. Essa è caratterizzata da ossa fragili soggette a fratture multiple e non ha cura. In questo progetto, abbiamo migliorato una nuova terapia sperimentale mediante una molecola chiamata siRNA da noi sviluppata, la quale riduce l'espressione del gene mutato CLCN7, senza influenzare l'espressione del gene normale. In particolare, abbiamo utilizzato un siRNA contro la mutazione Clcn7G213R (siRNA CLCN7G215R nell'uomo) attivo in tutto l'organismo. A tal fine, il siRNA Clcn7G213R è stato somministrato in combinazione con piccole particelle (nanoparticelle) diverse dai virus. Due formulazioni, che abbiamo chiamato A e B, sono state somministrate in vivo in topi ADO2. La formulazione A è risultata efficace ma altamente tossica alla dose di 4 mg/Kg di siRNA, somministrata per via intraperitoneale 3 giorni alla settimana per 4 settimane. Una dose più bassa (2mg/Kg di siRNA) ha ridotto l'espressione del gene mutato nei femori, inducendo un miglioramento significativo delle alterazioni ossee. Al contrario, questa dose non ha migliorato la qualità dell'osso, il quale è rimasto fragile. Inoltre, l'espressione del gene mutato si è ridotta nei polmoni ma non nelle cellule del sangue o in altri organi affetti dall'ADO2, limitando così gli effetti della cura. Al contrario, la formulazione B, somministrata alla dose di 4 mg/Kg di siRNA, è stata ben tollerata e più efficace nel ridurre l'espressione del gene mutato nell'osso, ripristinando condizioni simili a quelle dei topi normali. Inoltre, la qualità dell'osso è migliorata. Infine, l'espressione del gene mutato è stata ridotta nelle cellule del sangue ed in tutti gli altri organi valutati, tranne il cervello, probabilmente a causa della barriera presente fra questo ed il sangue. La formulazione B è stata quindi selezionata per studi di tossicità in topi non malati, i quali sono stati trattati con la massima concentrazione di siRNA consentita dalla combinazione con le nanoparticelle (8 mg/Kg siRNA), somministrata per via intraperitoneale 5 giorni alla settimana per due settimane. Il trattamento non ha causato decessi né ha indotto effetti collaterali quali reazioni cutanee nel sito di iniezione, compromissione della capacità di camminare, o cambiamenti del comportamento e dell'assunzione di cibo. Coerentemente con queste osservazioni, il peso dei topi è aumentato progressivamente in modo normale e, dopo il sacrificio, i pesi di cervello, polmoni, cuore, reni, fegato e milza non hanno mostrato cambiamenti rispetto ai pesi degli stessi organi in topi di controllo trattati solo con la soluzione salina usata per somministrare la terapia. In conclusione, i nostri risultati indicano che la formulazione B di siRNA Clcn7G213R-nanoparticelle potrebbe essere sfruttata per lo sviluppo futuro di una cura efficace per i pazienti affetti da ADO2.
Disease Name:
Autosomal Dominant Osteopetrosis Type 2
Nome malattia:
Osteopetrosi Autosomica Dominante di Tipo 2