NANOBODY-MEDIATED MODULATION OF HCN1 CHANNELS IN EPILEPTIC DISORDERS Hyperpolarization-activated cyclic-nucleotide gated 1 (HCN1) channels contribute to the cationic Ih current in neurons and are involved in the control of neuronal excitability[. Several mutations in the HCN1 gene have been correlated with the insurgence of Early Infantile Epileptic Encephalopathy (EIEE), a severe form of epilepsy characterized by recurrent seizures with impaired cognitive and motor development with onset in the first year of life, that doesn't have a targeted treatment yet. In search of modulators that can reduce, and possibly abolish, HCN1-related phenotypes, nanobodies (NBs) represents a future therapeutic tool with great potential. By screening a synthetic library, we have isolated several nanobodies that specifically target HCN channel subtypes. We show here that nanobody #5 is able to revert the phenotype, 8mV right shift in voltage-dependency, caused by the pathogenic R548H mutation of the hHCN1 channel. Notably, the nanobody acts from the extracellular side of the channel presumably binding to the voltage sensor, while the mutation, previously characterized, affects cAMP binding to the intracellular Cyclic Nucleotide Binding Domain (CNBD) of the channel. This result opens valuable therapeutical perspectives for EIEE patients and further highlights that in HCN channels voltage sensing at the membrane and ligand binding at the cytosolic domain are mutually interconnected.

Nuove prospettive terapeutiche per i pazienti EIEE con mutazioni in HCN1, basate su nanobody che legano il canale. I canali ionici HCN1 contribuiscono alla corrente cationica Ih nei neuroni e sono coinvolti nel controllo dell'eccitabilità neuronale. Diverse mutazioni nel gene HCN1 sono state correlate all'insorgenza dell'Encefalopatia Epilettica Precoce Infantile (EIEE), una grave forma di epilessia caratterizzata da crisi ricorrenti con compromissione dello sviluppo cognitivo e motorio con esordio nel primo anno di vita. I nanobodies (NB) rappresentano uno strumento terapeutico dal grande potenziale in quanto possono legarsi al canale modificandone l'attività e/o possibilmente abolendola in modo da mitigare l'effetto delle mutazioni. Dopo aver isolato da una libreria sintetica diversi nanobodies che riconoscono specificamente i canali HCN, abbiamo dimostrato che il nanobody #5 è in grado di invertire il fenotipo, lo spostamento di 8mV della curva di attivazione, causato dalla mutazione patologica R548H del canale hHCN1. In particolare, il nanobody agisce dal lato extracellulare del canale legandosi presumibilmente al sensore di voltaggio, mentre la mutazione, precedentemente caratterizzata, influisce sul legame del ligando cAMP al dominio intracellulare (CNBD) del canale. Questo risultato apre preziose prospettive terapeutiche per i pazienti affetti da EIEE e sottolinea ulteriormente che nei canali HCN il rilevamento del voltaggio a livello della membrana e il legame con il ligando nel dominio citosolico sono funzionalmente interconnessi.

early infantile epileptic encephalopathy (EIEE)

encefalopatia epilettica infantile precoce (EIEE)