Progressive familiar intrahepatic cholestasis type 2 (PFIC-2) is an autosomal recessive metabolic disorder caused by mutations in ABCB11 gene encoding the hepatocyte bile salt transporter. Consequently, secretion of bile is impaired, causing jaundice, pruritus, fibrosis and leading to liver failure. Most patients ultimately undergo liver transplantation as only curative option. Liver directed in vivo genome editing would potentially allow for a stable gene correction in PFIC-2 paediatric patients, thus preventing liver toxicity. Here we aim to evaluate the efficiency of a CRISPR-Cas9 platform for integrating the ABCB11 cDNA under the control of its endogenous promoter, by delivering the donor DNA in vivo with viral vectors. Since PFIC-2 patients present liver fibrosis early in life, it is essential to assess its impact on viral vector mediated hepatocyte transduction. We designed guide RNAs (gRNA) targeting the first intron of ABCB11 to address all described mutations and maintain as much as possible physiologic gene expression. We screened 12 guide RNAs for cutting efficiency in hepatocyte cell lines and selected the best performing ones. We then tested different integration strategies based on homology directed repair (HDR), micro-homology mediated end-joining and homology-independent targeted integration. We observed that the most efficient integration was obtained with HDR-based donor DNAs in this setting. To assess the impact of fibrosis on transduction, we intravenously administered lentiviral vector (LV) encoding for a reporter gene to CCl4 treated mice, displaying severe pericentral fibrosis. In this model we observed a reduced LV transduction. The same experiment was performed in 6-month-old PFIC-2 mice, a model of mild periportal fibrosis, showing a slight reduction of LV transduction. Overall, these data provide the basis to further develop in vivo genome editing and to assess the best therapeutic window for the treatment of PFIC-2 patients.

La colestasi intraepatica familiare progressiva di tipo 2 (PFIC-2) è una malattia metabolica autosomica recessiva causata da mutazioni nel gene ABCB11, che codifica per il trasportatore dei sali biliari espresso sulla membrana cellulare degli epatociti. Di conseguenza, la secrezione di bile da parte del fegato è compromessa. Ciò causa ittero, prurito, fibrosi e può portare all'insufficienza epatica. La maggior parte dei pazienti viene sottoposta a trapianto di fegato quale unico trattamento curativo. L'editing del genoma degli epatociti permetterebbe potenzialmente una correzione stabile della patologia nei pazienti pediatrici con PFIC-2, prevenendo così lo sviluppo della malattia e la conseguente tossicità epatica. In questo progetto intendiamo valutare l'efficacia di una strategia di editing genomico basata sull'utilizzo di CRISPR-Cas9. L'enzima Cas9, guidato da un RNA guida (gRNA), è in grado di tagliare il DNA in un punto preciso. Se a questo sistema si aggiunge un DNA donatore è possibile inserire una sequenza desiderata nel sito di taglio. Il nostro obiettivo è quindi inserire una sequenza di DNA codificante per ABCB11 sotto il controllo del promotore endogeno del gene, sfruttando vettori virali per far arrivare il DNA donatore agli epatociti. Poiché i pazienti PFIC-2 sviluppano fibrosi epatica in età pediatrica, è essenziale valutare l'impatto della fibrosi sul trasferimento genico agli epatociti mediato da vettori virali. Abbiamo disegnato diversi gRNA che avessero come bersaglio il primo introne di ABCB11 per correggere tutte le mutazioni descritte e mantenere il più possibile l'espressione genica fisiologica. Abbiamo testato 12 gRNA in linee cellulari confrontando l'efficienza di taglio e selezionando quelli con le migliori prestazioni. Abbiamo poi testato alcune strategie di integrazione per il DNA donatore basate su diversi meccanismi: la riparazione per ricombinazione (HDR), la saldatura delle estremità mediata da micro-omologie e la saldatura delle estremità non omologhe. L'integrazione più efficiente è stata ottenuta con DNA donatori basati sul meccanismo di HDR. Per valutare l'impatto della fibrosi sul trasferimento genico abbiamo sfruttato un modello murino di fibrosi indotta chimicamentre tramite CCl4, che presenta una fibrosi epatica pericentrale grave. Abbiamo somministrato a questi topi un vettore lentivirale (VL) codificante per un gene reporter. In questo modello abbiamo osservato una riduzione del trasferimento genico mediato da VL, osservando una diminuzione dell'espressione del transgene. Lo stesso esperimento è stato eseguito in topi PFIC-2 di 6 mesi, un modello di fibrosi epatica periportale lieve. In questo modello abbiamo osservato una modesta riduzione dell'espressione del transgene veicolato tramite VL. Nel complesso, questi dati forniscono informazioni importanti per lo sviluppo della strategia di editing genomico di ABCB11 e per stabilire la migliore finestra terapeutica per il trattamento dei pazienti PFIC-2.

Progressive familiar intrahepatic cholestasis

Colestasi intraepatica familiare progressiva di tipo 2