Heterozygous mostly de novo variants of the ACTG2 gene are detected in around 50% of patients with visceral myopathy (VSCM) (1,2). Clinical treatment is still limited, knowledge about pathogenic mechanisms is poor, and new therapeutic approaches are urgently needed to restore smooth muscle function (3-6).
In the present Seed Grant Telethon Project we aimed to test the hypothesis that VSCM is underpinned by misfolded ACTG2 mutant proteins, challenging protein quality control and proteolytic degradation systems, and to obtain information on druggable genes / pathways / processes. To this end, fibroblasts from 4 patients with ACTG2 variants (3 severe p.R257C and 1 mild p.R38H), 5 non-CIPO or healthy controls and 3 Hirschsprung patients (HSCR) have been studied for: i) cell phenotype, ii) intracellular aggregates, iii) proteasome and autophagy, iv) effect of candidate drugs.
The morphological analysis of the F-actin cytoskeleton concerned the texture and the anisotropy of the cytoskeleton filaments. Only anisotropy was able to slightly distinguish VSCM from non-CIPO and HSCR controls and, interestingly, to robustly discriminate severe VSCMs from all controls. Moreover, aggregates resulted more frequent in VSCM cells than in control fibroblasts and co-localized with Ubiquitin and HSP27, two players of the heat shock response and proteasome mediated degradation of putatively unfolded proteins.
Proteasome and autophagy enhancers and inhibitors allowed to confirm that these two cellular clearance machineries are involved in VSCM pathogenesis, being unable to cope with the degradation of all the defective ACTG2 proteins, compared to non-CIPO and healthy controls, and that drugs known to modulate these processes consistently present abnormal responses.
Finally, the whole aggregate proteome was characterized by mass-spectrometry in 4 patient and 2 control fibroblast cell lines, thus revealing >7000 proteins, 515 of which significantly modulated between the two cohorts. The GO Biological Process annotations confirmed the expected involvement of VSCM cells in "microtubule cytoskeleton organization", "smooth muscle cell migration", "actin filament-based movement" as well as the enrichment of unexpected pathways that highlighted potential roles of ACTG2 in nuclear DNA functions and mitochondrial and ribosomal biogenesis and homeostasis. Other studies will also be needed to investigate the role that ACTG2 has shown in the nucleus and in activities related to cell replication and gene expression.
La miopatia viscerale (VSCM) è un grave difetto della motilità gastro-intestinale dovuto alla presenza di varianti, dovute principalmente ad eventi mutazionali de-novo, del gene codificante per l'actina del muscolo liscio viscerale (ACTG2). Il trattamento clinico della VSCM è ancora limitato, concentrandosi principalmente sulla gestione dei sintomi piuttosto che sul trattamento della malattia: i pazienti sono spesso sottoposti a chirurgia addominale e alla sostituzione del cibo con nutrizione parenterale totale. Nuovi approcci terapeutici per ripristinare la funzione muscolare e migliorare la qualità di vita dei pazienti sono auspicabili.
Sia i dettagli molecolari dei meccanismi patogenetici alla base della VSCM che i possibili bersagli farmacologici non sono stati indagati a sufficienza. Nel presente progetto abbiamo verificato l'ipotesi che la patogenesi molecolare della VSCM sia sostenuta dalla persistenza di proteine ACTG2 incapaci di ripiegarsi correttamente, dalla risposta allo stress cellulare e dal blocco dei sistemi di clearance cellulare, cioè ubiquitina-proteasoma e autofagia.
A questo scopo, i fibroblasti di 4 pazienti con varianti ACTG2 (3 p.R257C grave e 1 p.R38H lieve), 5 controlli non CIPO o sani e 3 pazienti Hirschsprung (HSCR) sono stati studiati per: i) fenotipo cellulare, ii ) aggregati intracellulari, iii) proteasoma e autofagia, iv) effetto di farmaci candidati.
L'analisi morfologica del citoscheletro di F-actina mediante la misura dell'anisotropia è stata in grado di distinguere VSCM (specialmente le cellule derivanti da pazienti gravi) dai controlli non CIPO e HSCR. Inoltre, gli aggregati sono risultati più frequenti nelle cellule VSCM che nei fibroblasti di controllo e co-localizzati con Ubiquitina e HSP27, due attori della risposta allo stress cellulare e del proteasome. L'uso di potenziatori e inibitori di questi sistemi di smaltimento delle proteine difettose hanno permesso di confermare il loro coinvolgimento nella patogenesi della VSCM, non essendo in grado di far fronte alla degradazione di tutte le proteine ACTG2 mutate, rispetto ai controlli sani e non-CIPO.
Infine, l'intero set di proteine dei fibroblasti sotto esame è stato caratterizzato mediante spettrometria di massa in cellule di 4 pazienti e 2 controlli, rivelando 515 proteine significativamente modulate tra le due coorti. Le annotazioni effettuate hanno confermato il previsto coinvolgimento delle cellule VSCM nell'"organizzazione del citoscheletro dei microtubuli" e nella "migrazione delle cellule muscolari lisce", nonché potenziali ruoli di ACTG2 inattesi nelle funzioni del DNA nucleare e nella biogenesi e omeostasi mitocondriale e ribosomiale. Saranno necessari anche altri studi per indagare il ruolo che l'ACTG2 ha mostrato nel nucleo e nelle attività legate alla replicazione cellulare e all'espressione genica.
1. Assia Batzir et al. Recurrent arginine substitutions in the ACTG2 gene are the primary driver of disease burden and severity in visceral myopathy. Hum Mutat. 41(3):641-654;2020.
2. Matera et al. Novel ACTG2 variants disclose allelic heterogeneity and bi-allelic inheritance in pediatric chronic intestinal pseudo-obstruction. Clin Genet. 99(3):430-436;2021.
3. Hashmi et al. Visceral myopathy: clinical syndromes, genetics, pathophysiology, and fall of the cytoskeleton. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 320(6):G919-G935;2021.
4. Wangler & Beaudet. ACTG2-Related Disorders. In: Adam et al editors. GeneReviews® [Internet]. Seattle (WA): University of Washington, Seattle; 1993-2016, 2015.
5. Halim et al. ACTG2 variants impair actin polymerization in sporadic Megacystis Microcolon Intestinal Hypoperistalsis Syndrome. Hum Mol Genet. 25(3):571-83;2016.
6. Hashmi et al. Pseudo-obstruction-inducing ACTG2R257C alters actin organization and function. JCI Insight. 5(16):e140604;2020.