Copper operates as an essential cofactor of several enzymes driving vitally important processes in human body. However, the excess of this metal is toxic. Therefore, copper import, distribution and storage require orchestrated action of several ion transport, membrane trafficking and quality control mechanisms. Such mechanisms are seriously compromised in Wilson disease (1-3). Wilson Disease (WD) is caused by mutation in the gene encoding the hepatic copper transporter ATP7B. In response to elevated copper ATP7B traffics from the Golgi to lysosomes and biliary surface of hepatocytes, where promotes sequestration and further efflux of the excess metal (4). Loss of ATP7B function leads to toxic accumulation of copper (Cu) in the liver and in the brain with the development of severe hepatic, neurological and psychiatric symptoms. Current therapeutic strategies for WD are restricted to reducing copper absorption or Cu chelation. However, although effective, those treatments present serious side effects or limited efficiency in a large cohort of patients. Therefore, there is an urgent need to find alternative therapeutic options.
For this purpose, we used bioinformatics and high throughput screenings to identify FDA (Food and Drug Administration) approved drugs able to counteract Cu toxicity in cell model of WD. Through a number of validation assays, five drugs were selected as potential therapeutic agents promoting WD cell viability and reducing apoptosis upon Cu exposure. To prove their effectiveness, all five drugs were tested in Atp7b knockout (Atp7b-/-) mice, a bona fide animal model of WD using either IP injections (4 drugs) or drug-containing diet (1 drug). Upon daily IP injections for 4 weeks, only one compound (encoded FDA#7) exhibited a clear capacity to alleviate WD manifestations in Atp7b-/- mice. Indeed, FDA#7-treated mice showed significant decrease in serum liver damage markers and a substantial reduction in liver inflammation and fibrosis compared to control mice. Another drug (encoded FDA#8) was supplied with the diet and significantly reduced liver damage and delayed the disease onset in Atp7b-/- mice. Further RNA-seq analysis revealed that both drugs were able to activate autophagy that serves as pro-survival mechanism to help ATP7B-deficient hepatic cells to counteract Cu toxicity.
Considering the safety-profile and tolerability of AD, these drugs emerge as attractive candidates which might be used for rapid development of new therapeutic strategies for WD.
Meccanismi molecolari che coordinano il traffico di membrana e il trasporto di ioni nella malattia di Wilson
Il rame funziona come un cofattore essenziale di diversi enzimi che guidano processi vitali importanza nel corpo umano. Tuttavia, l'eccesso di questo metallo è tossico. Pertanto, l'importazione, la distribuzione e lo stoccaggio del rame richiedono un'azione orchestrata di diversi meccanismi di trasporto ionico, traffico di membrane e controllo della qualità. Tali meccanismi sono seriamente compromessi nella malattia di Wilson (1-3). La malattia di Wilson (MDV) è causata da mutazioni nel gene che codifica per il trasportatore epatico del rame ATP7B. In risposta all'elevato rame ATP7B traffica dal Golgi ai lisosomi e alla superficie biliare degli epatociti, dove promuove il sequestro e l'ulteriore efflusso del metallo in eccesso (4). La perdita della funzione di ATP7B porta all'accumulo tossico di rame nel fegato e nel cervello con lo sviluppo di gravi sintomi epatici, neurologici e psichiatrici. Le attuali strategie terapeutiche per la MDV si limitano a ridurre l'assorbimento del rame. Tuttavia, sebbene efficaci, tali trattamenti presentano gravi effetti collaterali o un'efficienza limitata in una grande coorte di pazienti. Pertanto, esiste bisogno di trovare opzioni terapeutiche alternative.
A questo scopo, abbiamo utilizzato la bioinformatica e lo high content screening per identificare farmaci approvati dalla FDA (Food and Drug Administration) in grado di contrastare la tossicità del Cu nel modello cellulare di MDW. Attraverso una serie di test di convalida, cinque farmaci sono stati selezionati come potenziali agenti terapeutici che promuovono la vitalità delle cellule MDV e riducono l'apoptosi dopo l'esposizione a rame. Per dimostrare la loro efficacia, tutti e cinque i farmaci sono stati testati in topi knockout Atp7b (Atp7b-/-), un modello animale di MDW utilizzando iniezioni IP (4 composti) o dieta contenente farmaci (1 composto). Dopo iniezioni IP giornaliere per 4 settimane, solo un composto (codificato FDA # 7) ha mostrato una chiara capacità di alleviare le manifestazioni di MDW nei topi Atp7b-/-. Infatti, i topi trattati con FDA # 7 hanno mostrato una significativa diminuzione dei marcatori di danno epatico e una sostanziale riduzione dell'infiammazione epatica e della fibrosi rispetto ai topi non trattati. Un altro farmaco (codificato FDA # 8) è stato fornito con la dieta e ha ridotto significativamente il danno epatico e ritardato l'insorgenza della malattia nei topi Atp7b-/-. Ulteriori analisi con RNA-seq hanno rivelato che entrambi i farmaci sono stati in grado di attivare l'autofagia che funge da meccanismo pro-sopravvivenza per aiutare le cellule epatiche carenti di ATP7B a contrastare la tossicità del rame.
Considerando il profilo di biosafety e la tollerabilità, questi farmaci emergono come candidati interessanti che potrebbero essere utilizzati per un rapido sviluppo di nuove strategie terapeutiche per la MDW.
1. Chesi G, Hegde R, et al., Polishchuk RS (2016) Identification of p38 MAPK and JNK as new targets for correction of Wilson disease-causing ATP7B mutants. Hepatology. 63: 1842-1859
2. Polishchuk EV, Merolla A, et al., Polishchuk RS. (2019) Activation of autophagy, observed in liver tissues from patients with Wilson disease and from Atp7b-deficient animals, protects hepatocytes from copper-induced apoptosis. Gastroenterology, 156: 1173-1189.
3. Concilli M, Petruzzelli R, et al., Polishchuk RS. (2020) Pharmacoproteomics pinpoints HSP70 interaction for correction of the most frequent Wilson disease-causing mutant of ATP7B. Proc Natl Acad Sci USA. 117: 32453-32463.
4. Polishchuk EV, Concilli M, et al., Polishchuk RS. (2014) Wilson disease protein ATP7B utilizes lysosomal exocytosis to maintain copper homeostasis. Dev Cell. 29: 686-700.