PANK2 and COASY-associated neurodegeneration (PKAN and CoPAN) are caused by mutations in genes that codify for key enzymes on Coenzyme A (CoA) biosynthetic chain reactions (first and last two steps respectively). Both diseases are characterized by progressive neurodegeneration and excessive iron deposition in the brain. The hallmark of these diseases is the huge accumulation of iron in the globus pallidus brain region of patients. So far, it is still unknown how this alteration can cause the accumulation of iron in the brain. We used previously obtained hiPS-clones to generate either inhibitory neurons (PKAN) or a pure population of astrocytes (PKAN and CoPAN). We obtained PKAN striatal-like medium spiny neurons composed by GABAergic neurons and glial cells. Within this mixed population we detected iron deposition in both PKAN cell types, however the viability of PKAN GABAergic neurons resulted strongly affected. CoA treatment was able to reduce cell death and iron overload. A pure population of astrocytes showed a particularly evident iron accumulation, with about 50% of cells positive to Perls stain. These PKAN astrocytes indicated an alteration of iron metabolism, mitochondria morphology, respiratory activity, oxidative status, signs of ferroptosis and were prone to develop a stellate phenotype, thus gaining a neurotoxic feature. This feature was confirmed in astrocytes and glutamatergic neurons co-cultures, in which PKAN glutamatergic neurons resulted less viable in the presence of PKAN astrocytes. Analysis of constitutive exo-endocytosis, a key route for cellular iron intake, and vesicular dynamics, by exploiting the activity-enriching biosensor SynaptoZip, led to the finding of a general impairment in the constitutive endosomal trafficking in PKAN astrocytes. CoA and 4-phenylbutyric acid treatments were found to be effective in partially rescuing the aberrant vesicular behavior and iron intake. Experiments ran in CoPAN astrocytes showed iron overload (detected with Perls staining), a tendency to stellation and a positive significant correlation between the stellation grade and the amount of up taken transferrin. These preliminary results suggest a potential impairment in membrane dynamics that could be at the basis of iron overload also in CoPAN astrocytes. Thus, this astrocyte model results helpful not only to clarify pathogenetic mechanisms that lead to iron overload, but also to find common routes in two exemplar NBIA disorders. They could allow to test new therapeutic options, as for example the PPAR Gamma Agonist Leriglitazone that we found to be efficient in ameliorating mitochondrial function in PKAN astrocytes.

GLI ASTROCITI DI PKAN E COPAN MOSTRANO UN SOVRACCARICO DI FERRO E RISULTANO UTILI COME MODELLI PER TESTARE COMPOSTI TERAPEUTICI. PKAN e CoPAN sono causate rispettivamente da difetti in PANK2 e COASY, geni che codificano per gli enzimi chiave della catena biosintetica del Coenzima A (CoA). Entrambe le malattie sono caratterizzate da neurodegenerazione progressiva e l'enorme accumulo di ferro nella regione cerebrale del globus pallidus dei pazienti. Finora non si sa ancora come questa alterazione possa causare l'accumulo di ferro nel cervello. Abbiamo utilizzato cloni di cellule staminali pluripotenti, ottenuti in precedenza dai fibroblasti dei pazienti, per generare neuroni inibitori (PKAN) o una popolazione pura di astrociti (PKAN e CoPAN). Abbiamo ottenuto una popolazione di neuroni essenzialmente composta da neuroni GABAergici e cellule gliali, che mostrava l'accumulo di ferro in entrambi i tipi di cellule PKAN. Tuttavia la vitalità dei neuroni PKAN GABAergici è risultata fortemente ridotta. Il trattamento con CoA è stato in grado di ridurre la morte cellulare e il sovraccarico di ferro. Successivi esperimenti condotti su una popolazione pura di astrociti hanno mostrato un accumulo di ferro particolarmente evidente, con circa il 50% di cellule positive alla colorazione specifica per il ferro accumulato. Questi astrociti di PKAN presentavano un'alterazione del metabolismo del ferro, della morfologia dei mitocondri, dell'attività respiratoria, dello stato ossidativo e segni di ferroptosi. Inoltre, gli astrociti di PKAN sviluppavano un fenotipo reattivo, come una tendenza ad assumere morfologia stellata, acquisendo così una caratteristica neurotossica. Questa caratteristica è stata confermata in co-colture di astrociti e neuroni glutammatergici, in cui i neuroni PKAN sono risultati meno vitali in presenza di astrociti PKAN. Sono state condotte ulteriori analisi del traffico vescicolare costitutivo, una via chiave per l'assunzione del ferro cellulare. Questi esperimenti hanno sfruttato il biosensore SynaptoZip, il quale permette la marcatura delle vescicole attive e di seguire il loro destino. I risultati hanno dimostrato una compromissione generale del traffico endosomiale negli astrociti PKAN. I trattamenti con CoA, acido 4-fenilbutirrico si sono rivelati efficaci nel migliorare il comportamento vescicolare e l'incorporazione cellulare del ferro. Gli astrociti CoPAN hanno mostrato un sovraccarico di ferro e una tendenza ad assumere una morfologia stellata che correla con il ferro incorporato. Questi risultati preliminari suggeriscono una potenziale compromissione delle dinamiche di membrana. Questi modelli di astrociti risultano utili non solo per chiarire i meccanismi patogenetici che portano al sovraccarico di ferro, ma anche per trovare percorsi comuni in due esempi di NBIA, che potrebbero consentire di testare nuove opzioni terapeutiche, come ad esempio il Leriglitazone che abbiamo visto essere efficace nel migliorare il fenotipo PKAN.

1) Santambrogio P, Ripamonti M, Cozzi A, Raimondi M, Cavestro C, Di Meo I, Rubio A, Taverna S, Tiranti V, Levi S. Massive iron accumulation in PKAN-derived neurons and astrocytes: light on the human pathological phenotype. Cell Death Dis. 2022 Feb 25;13(2):185. 2) PKAN hiPS-Derived Astrocytes Show Impairment of Endosomal Trafficking: A Potential Mechanism Underlying Iron Accumulation. Front Cell Neurosci. 2022 Jun 16;16:878103. 3) Santambrogio P, Cozzi A, Di Meo I, Cavestro C, Vergara C, Rodríguez-Pascau L, Martinell M, Pizcueta P, Tiranti V, Levi S. PPAR Gamma Agonist Leriglitazone Recovers Alterations Due to Pank2-Deficiency in hiPS-Derived Astrocytes. Pharmaceutics. 2023 Jan 6;15(1):202.

PKAN and CoPAN

Neurodegenerazione associate a difetti di Pantotenate kinase-2 (PKAN)e difetti di COASY (CoPAN)