Congenital thrombotic thrombocytopenic purpura is an ultrarare recessive blood disorder characterized by the presence of microangiopathic haemolytic anaemia, thrombocytopenia and purpura caused by thrombi in the small vessels of many organs. It is characterized by the deficiency of ADAMTS13, a plasma protein that cleaves von Willebrand factor (VWF) multimers secreted by endothelial cells. The persistence of uncleaved, unusually large VWF multimers into the circulation causes platelet deposition and microthrombi formation. The current treatment, plasma infusion, is generally effective but complicated by the risk of infection and by allergic and anaphylactic reactions. Relapses are common and the mortality rate related to acute episodes remains high. Our aim is to develop a cell-based regenerative therapy based on the generation of induced pluripotent stem cells (iPSC) that are made hypoimmunogenic by ablating HLAI and HLAII, the main cause of immune-incompatibility, and therefore exploitable for all patients. To this end, using the CRISPR/Cas9 system, we successfully ablated the expression of CIITA, an HLAII transactivator, and β-2-Microglobulin (B2M), a protein required for the formation of a HLAI functional complex, on healthy IPSC. We isolated and characterized in depth a clone homozygous knockout for CIITA (c.278_279insA; p.A94Gfs*33), and compound heterozygous knockout for B2M (c.79_90delATTCAGGTTTAC, p.delI27-Y30; c.79_80delinsGTTTAC, p.I27Vfs*31) without unintended genomic mutations at off-target sites. HLAI and HLAII ablation did not affect its ability to differentiate towards hepatocytes, endothelial and hepatic stellate cells (the major ADAMTS13-producer cells). iPSC-derived hepatic stellate cells are able to synthetize ADAMTS13 paving the way for the generation of a hypoimmunogenic liver organoid that, once transplanted, releases constant therapeutic levels of functioning ADAMTS13 into the circulation protecting the patient against possible relapses.

Terapia cellulare per la cura della forma congenita della porpora trombotica trombocitopenica La porpora trombotica trombocitopenica congenita è una rara malattia del sangue caratterizzata dalla presenza di anemia emolitica microangiopatica, trombocitopenia e porpora causata dalla presenza di trombi nei piccoli vasi sanguigni di molti organi. All'origine della malattia c'è la carenza di una proteina, ADAMTS13, prodotta dalle cellule stellate epatiche e rilasciata nel sangue dove taglia i grandi multimeri di von Willebrand (vWF) secreti dalle cellule endoteliali. In carenza di ADAMTS13, i grandi multimeri di vWF si accumulano sulla superficie dei vasi sanguigni causando la formazione di microtrombi. I pazienti vengono trattati con infusioni di plasma, generalmente efficaci ma che danno complicanze quali reazioni allergiche e anafilattiche e rischi di infezione. Le ricadute sono comuni e il tasso di mortalità correlato agli episodi acuti rimane elevato. Il nostro progetto si propone di sviluppare un nuovo approccio terapeutico di medicina rigenerativa basato sulla generazione di cellule staminali pluripotenti indotte universali (iPSC), ovvero invisibili al sistema immunitario del paziente e quindi sfruttabili per tutti i pazienti. A tal fine abbiamo eliminato l'espressione di HLAI e HLAII, le principali cause di immuno-incompatibilità, in iPS derivate da un paziente sano. In particolare, utilizzando il sistema CRISPR/Cas9, abbiamo disattivato il gene CIITA, un fattore fondamentale per l'espressione di HLAII, e la β-2-microglobulina (B2M), una proteina necessaria per la formazione del complesso HLAI funzionale. Abbiamo quindi isolato e caratterizzato un clone knockout sia per CIITA che per B2M, privo di mutazioni genomiche indesiderate in altri punti del genoma. Le mutazioni in CIITA e B2M non hanno influenzato la capacità delle cellule di differenziarsi verso epatociti, cellule endoteliali e cellule stellate epatiche (le principali cellule produttrici di ADAMTS13). Inoltre abbiamo dimostrato che le cellule stellate epatiche derivate da iPSC sono in grado di sintetizzare ADAMTS13. Questi risultati sono propedeutici alla generazione di un organoide epatico ipoimmunogenico composto da epatociti, cellule endoteliali e cellule stellate epatiche, che, una volta trapiantato, rilasci in circolo livelli terapeutici costanti di ADAMTS13 funzionante proteggendo il paziente da possibili ricadute.

Kremer Hovinga JA, Coppo P, et al., Thrombotic thrombocytopenic purpura. Nat Rev Dis Primers. 2017 Apr 6;3:17020. doi: 10.1038/nrdp.2017.20. PMID: 28382967. Deuse T, Hu X, Gravina A et al., Hypoimmunogenic derivatives of induced pluripotent stem cells evade immune rejection in fully immunocompetent allogeneic recipients. Nat Biotechnol. 2019 Mar;37(3):252-258. doi: 10.1038/s41587-019-0016-3. Epub 2019 Feb 18. Romano E, Trionfini P et al., Generation of a homozygous CIITA knockout iPS cell line using the CRISPR-Cas9 system. Stem Cell Res. 2021 Oct 18;57:102580. doi: 10.1016/j.scr.2021.102580. Epub ahead of print. PMID: 34688128; PMCID: PMC8665218. Miyoshi M, Kakinuma S et al., LIM homeobox 2 promotes interaction between human iPS-derived hepatic progenitors and iPS-derived hepatic stellate-like cells. Sci Rep. 2019 Feb 14;9(1):2072. doi: 10.1038/s41598-018-37430-9. PMID: 30765795; PMCID: PMC6376133.

CONGENITAL THROMBOTIC THROMBOCYTOPENIC PURPURA

Porpora trombotica trombocitopenica congenita