The dystrophin-associated cardiomyopathy (DAC) is the leading cause of death in Duchenne and Muscular Dystrophy (DMD) patients with extremely divergent phenotypes. Discovering the mechanisms underlying DAC is an imperative unmet need and, to answer this, our study aims to:
-create a DMD patients' cardiovascular biorepository consisting of clinical data, biological samples and iPSCs;
-model the DAC in vitro using cardiomyocytes derived from patient specific iPSCs.
To create our biobank, we recruited 26 DMD patients, collected biological samples and clinical data and generated 9 iPSCs. In parallel, to study the underlying mechanisms of the variable DAC, we verified if patients, in addition to dystrophin mutations, carry alteration in other genes associated to cardiomyopathies. NGS results showed that the 60% of patients have a VUS in one or more of these genes. To model DAC, we used iPSC-derived cardiomyocytes (CMs). We verified that DMD CMs showed at 90 days reduced Ca transient (CaT) amplitude and faster CaT rise and RT50, compared to control CMs. Moreover, higher stiffness did not modify CaTs in DMD CMs, as observed in control, but led to higher SR Ca content. To better model DAC, we developed an engineered heart tissues (ETH) that was used to measure contractile force. Preliminary results showed that DMD-EHTs produced less contractile force compared to control-EHTs. Finally, to better characterize the cardiac electrophysiology, we develop an alternative optical approach, MULTIPLE, that combines optical detection of action potentials with optical stimulation, employing optogenetic actuators. The capability of MULTIPLE to detect action potential changes was demonstrated in HL-1 cells (mouse atrial myocyte-like cells) stably expressing the blue light-activatable cation channel CheRiff and employing the selective Kv11.1 channel blocker (E-4031) in a dose titration experiment.
In conclusion, our DMD biobank pave the way to a better study of the DAC by allowing the correlation of patient clinical data with the in vitro readouts.
TITOLO: Verso la medicina di precisione per la cardiomiopatia distrofica mediante l'utilizzo di cellule staminali pluripotenti indotte umane
Il coinvolgimento cardiaco risulta essere sempre più frequente nei pazienti affetti da distrofia muscolare di Duchenne e Becker, due sindromi causate da mutazioni nel gene della distrofina. Le terapie esistenti hanno effetto per lo più sui sintomi e non agiscono sui meccanismi causativi della cardiomiopatia associata alla distrofia, che ad oggi risulta essere la principale causa di morte in questi pazienti. Al momento, non sono ancora stati identificati genotipi o marcatori biologici che permettano di identificare e stratificare i pazienti che svilupperanno la cardiomiopatia. Il nostro gruppo ha dimostrato che le cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC), ottenute dalla riprogrammazione di cellule somatiche derivanti da pazienti, possono essere differenziate in cardiomiociti (le cellule del cuore) (iPS-CM) che mostrano un fenotipo patologico. Identificare i meccanismi che stanno alla base dello sviluppo e della variabilità della cardiomiopatia in pazienti affetti da distrofia muscolare risulta essere fondamentale e per questo il nostro progetto ha come obiettivi:
-la creazione di una biorepository cardiovascolare di pazienti con distrofia muscolare, ossia una collezione di dati clinici dei pazienti, materiale biologico (ad esempio sangue) e iPSC;
-lo studio in laboratorio della cardiomiopatia mediante il modello basato sui iPS-CM.
Per creare la biobanca, 26 pazienti affetti da distrofia muscolare sono stati reclutati e per ognuno sono stati raccolti i dati clinici, con particolare attenzione all'aspetto cardiaco, e i campioni biologici comprendenti il sangue e le cellule del sangue. Sono quindi stati selezionati 9 pazienti da cui sono state ottenute le iPSC mediante riprogrammazione delle cellule del sangue. Studi di laboratorio sui iPS-CM paziente specifiche hanno dimostrato che in tali cellule si hanno alterazioni del calcio intracellulare, uno ione che interviene in differenti processi cellulari quali la contrazione. In aggiunta, per meglio studiare tale cardiomiopatia, è stato sviluppato un sistema tridimensionale che ricrea in modo più accurato il cuore creando dei tessuti cardiaci ingegnerizzati. Infine, è stato sviluppato anche un nuovo strumento per studiare meglio in laboratorio l'elettrofisiologia dei cardiomiociti (ovvero le caratteristiche elettriche).
In conclusione, questa biorepository potrà essere utilizzata e sarà un utile strumento per i ricercatori che studiano la cardiomiopatia associata alla distrofia muscolare, permettendo di correlare i dati clinici dei pazienti con i risultati ottenuti in laboratorio utilizzando i iPS-CM. Inoltre, sarà possibile approfondire e determinare i meccanismi alla base dello sviluppo della cardiomiopatia, e possibilmente di scoprire marcatori che permettano di predire lo sviluppo della cardiomiopatia stessa nei pazienti affetti da distrofia muscolare.