TCF4 loss-of-function variants cause Pitt-Hopkins syndrome (PTHS, OMIN 610954), a rare disease associating intellectual disability (ID), wide mouth, distinctive facial features, and intermittent hyperventilation followed by apnea. Pathogenic missense variants are primarily clustered within the bHLH domain required for dimerization and DNA binding. Using exome sequencing, Prof. Antonio Vitobello, identified de novo missense variants in TCF4 in three individuals who did not show typical PTHS hallmarks. The variants affect ultra-conserved amino acids within the bHLH domain. Preliminary data on patients' samples suggested that TCF4 novel variants could induce a gain of function phenotype suggesting a novel molecular pathogenetic mechanism. These individuals show consistent phenotypic features associating cranio-facial dysmorphism, limb anomalies and growth failure without ID. The first goal of our project is to functionally study the three de novo variants of TCF4 in vivo. The second goal is to generate, by CRISPR/Cas9n approach, zebrafish lines representing new in vivo models for the PTHS and the novel TCF4 Met/Lys variant, to find and validate new TCF4 targets and to provide the scientific community in vivo platforms for drug screening. Due to the complexity of neurodevelopmental genetic disorders the use of animal models is still required. On the other hand, the experimentation with animals could be costly, time consuming and could raise ethical concerns. We design a project aimed to solve these limitations without affecting efficiency and efficacy. The use of a non-mammalian species reduces the ethical impact of the project following the international guidelines on the 3R principles.
We will also generate a PTHS model reproducing the Arg576Trp mutation in zebrafish known to be associated with a loss of function phenotype in patients. In case of success, we will provide new zebrafish lines phenocopy the human patient's condition generating their "avatars" for drug testing in the perspective of precision medicine. Contingency plan: In case the CRISPR/Cas9nickase gene editing approach will not work, we can identify TCF4 and TCF4 variants target genes by comparing transcriptome profile of the patients' fibroblasts to that of zebrafish brain and craniofacial tissues overexpressing TCF4 or TCF4 variants. To model PTHS, as contingency plan, we have two possibilities: 1) to overexpress the Arg576Trp TCF4 mRNA in zebrafish embryos to test a dominant negative effect in combination with a tcf4 splicing morpholino to downregulate the endogenous gene; 2) further characterize a tcf4 zebrafish knock out line that we recently obtained in the lab presenting a 13 nucleotides deletion with the formation of premature stop codon into the exon coding for the tcf4 bHLH domain. This project can also represent a proof of concept to develop new strategies for other rare diseases. From bed to fish tank and back!
L'avvento delle nuove tecnologie CRISPR/Cas9 ci permette oggi di generare nuovi modelli per lo studio delle patologie genetiche rare. Nel nostro progetto proponiamo di riprodurre nel pesciolino zebrafish mutazioni specifiche identificate nel gene TCF4 in pazienti affetti da Sindrome di Pitt-Hopkins e in tre bambini in studio con nuove mutazioni mai descritte. A causa della complessità dei disordini genetici dello sviluppo l'uso di modelli animali è ancora necessario per studiare gli effetti di specifiche mutazioni nell'intero organismo e saggiare la possibile tossicità e/o efficacia di nuovi trattamenti. Il nostro progetto tiene in considerazione le problematiche etiche legate a questi aspetti utilizzando un pesciolino come modello ricucendo così la sperimentazione sui mammiferi riservandola alle fasi precliniche più avanzate. Le larve di zebrafish porteranno la stessa mutazione dei pazienti in studio e saranno il loro "avatar acquatico" su cui saggiare nuovi trattamenti che speriamo siano suggeriti dalla nostra ricerca. Il progetto contribuirà inoltre a studiare aspetti ancora non conosciuti della patologia e del ruolo del gene TCF4. Il progetto ha come punto di forza il forte legame tra ricerca di base e applicata. Consapevoli della grande sfida alla base dei progetti sulle malattie rare riteniamo che la nostra proposta produrrà conoscenze e risultati in grado di accelerare l'identificazione di nuovi interventi terapeutici per i pazienti Pitt-Hopkins e con nuove mutazioni nel gene TCF4 nell'ottica della medicina personalizzata e rappresentare un esempio di nuovo approccio comparativo e integrato uomo/pesce per sviluppare nuove strategie anche per altre malattie rare.